脂肪干细胞培养资料及相关仪器

小云龙

一、        背景知识
; Z1 i+ {  J- E' M4 [" H7 e0 |临床上因先天性畸形、外伤及肿瘤切除术等各种原因所造成的软组织缺损的修复是整形修复外科面临的重大难题之一。脂肪组织瓣、胶原注射剂、真皮移植、人工合成材料以及游离脂肪组织移植虽已被广泛应用于临床工作中，但人工合成材料易产生异物排斥反应，而自体组织移植又带来供区的继发畸形，临床最常采用的游离脂肪组织移植也面临着移植物再吸收，纤维组织替代和油脂囊肿形成等问题。通常移植物体积减少40一60%的现象，究其原因，游离移植后数以万计或十万计脂肪细胞团块无法从受区获得足够的营养供应，导致移植后的脂肪细胞大量坏死。即使幸运得以存活的脂肪细胞也丧失继续增殖的能力，极易褪化，移植后数月逐渐丧失脂肪细胞特性，逐渐被成纤维细胞所替代。因此，如何有效保证游离移植物的血液供应，以保持其旺盛增殖状态，维持其脂肪细胞特性，是脂肪组织移植成功的关键。组织工程技术的出现为临床上彻底解决组织缺损等难题提供了一条革命性的途径。它能以少量种子细胞经体外扩增后与生物材料结合，修复较大的组织或器官缺损，重建缺损部位的生理功能。为最终实现无损伤修复组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新途径。& m4 e1 G2 C) z- ]
继骨髓基质细胞之后，抽脂来源的人脂肪组织干细胞成为当今干细胞研究领域的又一热点。脂肪组织作为干细胞来源的原因之一是由于从脂肪组织提取干细胞取材容易、量大、可反复取材、损伤较小、细胞增殖快速、能反复分裂而不衰老等优点，且可以把抽脂术中过去弃之的脂肪组织悬液变为人干细胞库的重要来源，可作为多种组织工程的种子细胞，具有非常重要的科学研究和应用价值。7 C+ {  c# P- r: t
据报道全球每年约完成一百万个吸脂手术，吸脂术能产生大量的脂肪抽吸物，脂肪组织抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增，对供区的损伤也小，可以反复进行。抽吸物中包含脂质和液体两部分，脂质的部分包括抽吸的脂肪组织碎片，这些碎片是由于吸脂管的相互运动和真空压力作用使脂肪组织变成了碎片。液体部分其基本组成包括：(l)麻醉药肿胀液中的生理盐水；(2)外周血液；(3)来源于脂肪组织的细胞和组织碎片。目前有关脂肪抽吸物的脂质部分已经被证实可以分离出具有向骨、软骨、脂肪、肌肉等多向分化能力的干细胞，而液态部分中有报道也包含类似的干细胞。我们可以同时富集脂质部分和液体部分来源的干细胞，以增加干细胞的数量，从而提高移植脂肪组织的成活率。
$ P2 I% O& B7 p7 Y3 @0 p1 o9 V二、  脂肪干细胞分离培养 # k+ c: ]! ]7 a3 J$ S) n# c
2.1 接收脂肪组织，用75%的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁；
3 N4 W- u5 j* j" d; I- n5 k& W2.2 分装脂肪组织，将脂肪组织分装到T175 培养瓶中：移液管，去吸头，于脂肪采集瓶先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。) c6 k" w! i2 y( S; E0 a' u; e
2.3 洗涤脂肪组织：向T175培养瓶中加入适量氯化钠注射液，充分洗涤脂肪组织；: c; u  Z' {9 v0 V* A" [4 v
2.4 胶原酶I 消化：加入胶原酶I溶液，封口膜封口，37℃消化，直到看起来较为平滑。
% U- q' f7 H2 J, z6 b2.5 分离基质血管组分（SVF）：将消化后的组织分装到50ml的离心管中，室温离心，得到的沉淀即为SVF。
  F; u1 y% D& A8 ?6 N& V2.6 净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温离心。
+ M# L, k% x5 n/ t0 @# n" O2.7 红细胞裂解：加入适量红细胞裂解液，裂解沉淀中的红细胞。再次离心。2 c9 S- z1 g; I/ U1 t
2.8 细胞种瓶进行后续培养或者直接输注给病人应用于临床。
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每ml抽脂得到的脂肪组织可以分离得到3×105个脂肪干细胞。
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培养中细胞
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; ^, _4 d- Y5 y成脂诱导分化
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所需仪器如下：+ x4 Y7 M+ D5 ^/ K) H0 G
设备名称        型号        备注( d: M4 W, N( _' c
超净工作台        苏净安泰，SW-CJ-2F        1台8 K  V0 j0 _5 W. G
电动移液器        Labnet        2把* k! R* W& w# z5 \' p4 X
电子天平        赛多利斯，ATL-224-I        1台1 h/ O3 W2 v7 P( z1 w( \3 {
IX71倒置式研究型显微镜        奥林巴斯，IX71        一台，可以暂时用普通显微镜替代
+ t' i% |+ i5 E# Z% K  c- Z架盘药物天平        马头牌，JYT-20A        一个# Y) ]9 M4 T0 B. K/ L7 A/ i5 U
台式离心机        久保田，8420        一台
1 P2 Q4 s1 ?0 D8 i. N9 }% V, j西门子冰箱        BCD-198        1台
  l& d, i4 W- f二氧化碳培养箱        三洋，MCO-20AIC        一个（可暂时不用配制）5 D- g& y. {! ~% L( p
台式恒温振荡器        上海精宏，THZ-312型        一台7 g6 F: Z- Q4 A9 o% a& q1 ]* ~( X
真空泵                细胞培养房吸废液用
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夜光猫

建议诱导分化做全，不仅要做成脂的，还要做成骨和成软骨的诱导。1 R: c6 _, O/ D
另，流式鉴定对于刚学做脂肪间充质的也是很重要的，检测细胞的纯度

121qwq

不是太详细，消化时间，离心力多大离心时间多久没提及

小云龙

回复 121qwq 的帖子* o' B4 ]* `3 D

( ]2 C$ L* q/ K, a6 K9 I% G4 [消化时间控制在半小时之内吧，我们试过还不错，离心的时间一般是1500-1分钟

121qwq

回复 小云龙 的帖子$ g1 w7 T* Q+ |; `, |6 X
+ d( b+ H6 [) r% `" p5 y. Z
好的，谢谢，那么培养基是用什么成分呢？

木头1102

脂肪干细胞分离：脂肪组织接收后用PBS清洗，分装至50ml离心管里，加入等提及的0.1%的胶原酶I；恒温振荡器中200r/min，消化45min；消化完成后300g，10min离心；吸出上清及油脂，PBS重悬；过滤掉未消化的组织，300g，5min离心；培养液重悬细胞，接种至培养瓶培养。长满后传代，一般原代细胞较杂，不易消化下来的细胞就不要了。传两到三代细胞纯度就可以了