关于ips细胞甲基化测序的问题

芦苇浅

使用Oct4-GFP transgene mice分离的OG-MEF细胞诱导重编程，如何利用亚硫酸盐测序方法检测多能性基因Oct4的Promoter区的甲基化情况？因为基因组中插入了一段外源的18Kb的Oct4-promoter驱动的GFP基因，亚硫酸盐处理后，PCR 扩增出来的片段怎么跟内源的promoter片段区别开呢？谢谢

Andyhigh

回复 芦苇浅 的帖子$ l+ t& |8 G* E

1 Y1 S3 b. T; N5 K% W! o; z1 M比较内外源性Oct4的Promoter，查找CpG富集的区域，在差异片段处设计引物 或者进行巢氏PCR 进行比较。- ]' u5 j- j+ ]. r: z
, c( U9 B3 y/ \* ]  W) [
只要有基因序列的，内外源性的影响应该可以排除，毕竟后续只有GC 的转变，其他碱基是一样的；

芦苇浅

回复 Andyhigh 的帖子3 f7 q, |2 {' S# u1 e

$ o% y, ?* }2 b谢谢您的回复。我不太理解的是这两段基因组区域是一样的啊，按说在基因组上的DNA甲基化情况也应该差不多吧，那如何寻找差异片段并设计引物呢？还是没太明白

Andyhigh

回复 芦苇浅 的帖子
6 [  B$ W, H  [1 y" U8 e$ |
+ e  u) ?) C8 q. {; h3 z- P" _* H3 E当初以为 两者是有明显差异的，如一个为人的 和 一个为鼠的；8 b4 `$ h- m! q8 W+ C9 f) I" X/ u
) c& Q% [4 m1 |; T+ T4 Z; f
如果都是小鼠的，你可以比较下两者的启动子序列，内源一般认为ATG前面大概5kb都是启动子序列（不太确定是5还是几，好像还有2），而外源性的是18kb，可以对比下两者的基因序列嘛。甚至可以利用软件预测下CPG岛的位置；
0 R; T1 A; B- M1 v6 M

Andyhigh

回复 芦苇浅 的帖子% B. T$ i8 |! S0 Q" C3 O

, j: g+ i8 ]# ^1 B6 Q) p: d当初以为 两者是有明显差异的，如一个为人的 和 一个为鼠的；
; a& T. A2 y* c* {( q# v) ~/ w' b
$ P( ~+ k2 H- w如果都是小鼠的，你可以比较下两者的启动子序列，内源一般认为ATG前面大概5kb都是启动子序列（不太确定是5还是几，好像还有2），而外源性的是18kb，可以对比下两者的基因序列嘛。甚至可以利用软件预测下CPG岛的位置；; n! f9 l; l. y5 c. B
  ?8 [: |- d) W3 \2 U# K7 ?

. F6 y" v& Q) H# T6 m补充内容 (2015-11-26 22:40):
+ J: I6 y5 N' u) c& O+ J$ |其实还是找差异，没有差异就没救啦，做一些Nang的启动子甲基化分析，比OCT4更多说明你iPS/ES的质量。
1 e3 ~6 m" C; r8 {0 V1 ]# x" y7 w2 L" n8 f, c3 v, `: u) @# A( J0 Y! ~) l8 r
补充内容 (2015-11-26 22:43):
$ V& X$ g% _+ Q" n+ f( k这只是一个检测指标而已，并且不是关键点，或者研究者非常感兴趣的东西，祝好运！