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标题: 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法 [打印本页]

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作者: 哇牛    时间: 2012-1-1 15:30     标题: 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法

看文献说脐带间充质干细胞有两种分离方法：酶消化法和贴壁法  不知道哪位大侠用过贴壁法，效果咋样？

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作者: king8    时间: 2012-1-1 22:43

的确是有两种方法，8 Z% a8 f; u  ?6 _2 n" O
两种方法都做过% n; {7 Q5 T9 U; i4 O+ [/ d
各有优缺点: d' @/ o/ m, X+ e& y* D
1 酶消化法
% W/ w" b) d; A0 a; F- e6 x优点：时间短       细胞状态好  
6 z" D6 u8 e! W* F缺点：操作复杂   费用高
, p9 N3 `2 F' B' t- c! N! \2 贴壁法
* _! m8 S" x% b) C% q优点： 操作简单  省钱
- t, @  _# l. d& w$ W0 b: y缺点： 时间长     细胞可能不纯/ }+ L: h# a$ p& ?
仅供参考

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作者: NK细胞    时间: 2012-1-4 08:27

作为养干细胞的新手，我只知道酶法，不知道贴壁法，求学习！
% m& O# ^( r! ?2 i% |. `8 A. w

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作者: 单个核细胞    时间: 2012-1-4 09:20

* W8 Z/ i# C# o1 b  X
  p* Q* Y: H& z5 f3 a( k/ ?$ N
回复 哇牛 的帖子
- O# Z: t) D5 J  Y, i7 J1 H& M- |  t4 M, s
[attach]37456[/attach]
: N# K- t, O9 F. }. T, @$ m8 A
' A+ J. {2 J% t9 P[attach]37455[/attach]$ i' Q" U! _" a- I' u0 S
. K7 N3 d- e  C( m# n) I
[attach]37457[/attach]

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作者: sanfa    时间: 2012-1-4 12:33

楼上给的很详细 给力啊

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作者: andreqin    时间: 2012-1-4 15:06

个人认为组织贴壁法比较好操作，而且后期传代培养很不错

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作者: suning5    时间: 2012-1-5 09:00

目前，临床治疗的生物公司，大多是用的组织贴壁法。细胞状态很好。获得量也很大

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作者: askage    时间: 2012-1-5 10:53

消化法：如果不采用胰酶，仅用胶原酶，原代可以很快培养出细胞，我们最短的4天就养出了原代细胞【细胞上百万】，而且细胞的性能也很不错。采用胰酶后，细胞的性能会受一些影响。这个是文献说的：对组织处理越多，细胞受到得伤害就越大，不处理最好。所以组织块法养出的细胞性能最好。就是养的时间长，有一定杂细胞，传代后可逐步纯化。; o- }5 l( W6 O; `; W6 G

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作者: 2008dentist    时间: 2012-1-5 11:00

个人实验经验认为，做脐带干细胞贴壁法成功率高，且所获得细胞较均一，利于后期挑单克隆等。

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作者: 荷荷    时间: 2012-1-6 09:10

如果要用于临床的话，个人感觉还是贴壁法好一些，成本低，外源因子引入的也少

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作者: deshenglll    时间: 2012-1-6 16:24

个人认为组织块法比较好。酶消化时间比较长。且对细胞有伤害。

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作者: xiaolong    时间: 2012-2-15 13:07

贴壁法，顶一个，不错

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作者: xylophone    时间: 2012-2-15 13:33

回复 单个核细胞 的帖子# M* V2 Y( y  P

) t' A# q. S0 P) x  Y请问你图片上的第一张2cm脐带的图 是去除了外膜的吗？; V( R# \9 T5 X( ~
血管切除时血管上会粘有很多华通胶，而最后得到很少的华通胶怎么办

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作者: crazytime    时间: 2012-2-15 23:53

有文章比较过两种方法，组织块贴壁法获得的细胞比较均一，但是时间长，可惜自己没有比较过这两种

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作者: 哇牛    时间: 2012-2-21 21:17

Method to Isolate Mesenchymal-Like Cells from Wharton’s Jelly of Umbilical Cord
: ]$ v, K7 c8 d7 f7 ]( k" Q2 j" i' B大家可以看下这篇文章，有详细的步棸及图片说明

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作者: yanlu98    时间: 2012-2-22 09:02

个人感觉贴壁法太慢了！我曾经贴壁和酶同时做，酶消化的都第二代了，贴壁法才刚刚可以传代，也有可能是我自己没有处理好，虽然原代处理的时候贴壁法的确没有多少成本，但是它的周期长，在这过程中又要不停地换液，还是要成本，所以我现在都用酶消化了。

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作者: yanlu98    时间: 2012-2-22 09:21

以前我同时做过贴壁法和酶消化法，贴壁法的周期太长了，当酶的已经传到第二代时，贴壁法还不能传代，虽然贴壁法原代处理时不需要多少成本，但是由于培养周期太长，期间要不停的换液，所以消耗的培养基也多，所以现在我一般都用酶的。

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作者: brian111    时间: 2012-2-22 09:42

回复 king8 的帖子2 A, v8 L# c6 z& U

+ B' B9 u0 t2 A/ n7 N这位兄台，不知道你说的机械法纯度不高是怎样一个标准？我没做过酶消化，只做过机械法。我们用的流式测纯度能到98左右，当然只是流式结果，其他的方面没有做。不知道酶消化能多高？还有有人说酶消化由于有化学物质，可能对细胞有损伤，你觉得有影响么？仅从细胞状态来说，这两种方法哪个更好些？

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作者: shizhu198511    时间: 2012-2-26 10:58

我酶消化法和组织块法都做过，酶消法快呀，1天就见到细胞贴壁，1周左右就可以传代，组织块最少7天才有细胞迁移出，传代最少要1月，我推荐酶消化法用的胶原酶2（浓度1mg/ml),消化4小时就可以了

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作者: xiaolong    时间: 2012-2-26 11:29

用过贴壁法，没用过酶消化法，所以没有比较过两者的效果哪个更好。不过对于贴壁法的看法，还是比较赞同“六楼”andreqin 的看法的。

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作者: xiaolong    时间: 2012-3-16 12:55

回复 单个核细胞 的帖子
0 ~2 ]. @$ _, x9 _# U: x$ D& c% H3 p* C* Q1 A
接种后，组织块有个贴壁的环节，贴壁效果好的，加培养液后，细胞会爬的很好，如果贴壁效果不好，组织块会漂在培养液里，细胞爬的效果很差，怎样能让组织块很好的贴壁？贴壁时间多久再加培养液会好些呢？

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作者: 单个核细胞    时间: 2012-3-16 16:32

回复 xiaolong 的帖子
3 d$ ^4 k0 R1 C2 k5 Q3 U- w' d
/ l4 O) f  `# S$ ^# y/ u+ f' _剥胶的时候，剥下来的华通胶直接放在50ml离心管内，全部剥完后剪碎，剪的过程中如果太黏，可以滴加少量PBS，不要滴太多。贴壁的时候用3ml吸管吸起组织，接种在培养瓶中。T75培养瓶每瓶贴20-25块，在培养箱中放置3-4小时后补加适量完全培养液。若是做的晚，可以第二天早上加液。以后观察的时候动作要轻盈，尽量不要使组织块漂起。7-10天后，会有细胞爬出，可以去掉组织块补加新鲜培养液继续培养，等到局部间充质干细胞密集的时候，可以传代。

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作者: xiaolong    时间: 2012-3-17 09:53

回复 单个核细胞 的帖子( s# H1 |, O- }" ^9 z; @6 }% T

6 R6 M$ A; h& n/ `, ?! r! r  q谢谢啊！

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作者: xiaolong    时间: 2012-3-17 12:21

回复 单个核细胞 的帖子) c6 w9 I: |; [5 F: K& _# A& ^" g4 S
/ X+ ~$ k& J0 U4 k9 d: p
再问，“在培养箱中放置3-4小时后补加适量完全培养液。若是做的晚，可以第二天早上加液”，如果组织块在培养瓶中贴壁，组织块在培养瓶中裸露的时间太久了，是不是会影响组织细胞的活性？

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作者: 单个核细胞    时间: 2012-3-19 09:39

回复 xiaolong 的帖子1 B+ [: \* P! V; w
$ i3 w1 g: A0 V' N/ K' ^
过夜我做过多次，没发现对细胞活性有影响。你也可以这样，刚贴完壁在每个贴壁的组织块上滴加一滴完全培养液，保持湿润就行，放置的目的主要是让组织块贴壁牢固，加入培养液后不至于漂起来。

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作者: xiaolong    时间: 2012-3-20 17:26

回复 单个核细胞 的帖子
& B5 _4 {" {' `$ V6 o
- K" }3 V& d: R+ l再谢谢啦

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作者: Demon_CN    时间: 2012-3-23 12:27

酶消化法比贴壁法细胞长的快，生产周期短，但是消化法技术要求高，消化时间掌握比较重要消化过度会伤细胞- h& ~4 N& y; @. t) W' f: ~' U
操作发杂一点，费用也要贵一点。+ c- E" Y1 z' W9 O
贴壁法，比较简单，但是周期长一点，我现在就用大概P1代冻存有10*7个细胞（养5个T75，传代一次）。缺点你懂的周期长。
  I* X" j2 P: E" v

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作者: xuyang0317    时间: 2012-4-19 17:55

个人觉得，贴壁法很好，速度经济，省钱省力省时，就是培养的时间要长点，爬片时注意不要污染，成功率是100%

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作者: xuyang0317    时间: 2012-4-19 18:52

你可以先加5分之一的培养液，第二天再补上，没问题的，我做过！

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作者: hyf198675    时间: 2012-5-3 19:16

回复 askage 的帖子
# N) V2 Q, x, v  n; R) h; }: N5 N
9 J# S$ _  j& i+ i: m你能不能和我说下你们的实验步骤啊？我正在做酶消化法培养间充干，但培养效果不好，拜托了！

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作者: xuzhijuan1989    时间: 2012-11-28 22:14

回复 askage 的帖子2 S7 a! l1 Y3 m" y

& F7 A9 `: _" Z1 Q你好，请问你用酶解法分离过期待MSC吗？具体怎么操作呢？胶原酶消化多久啊？用多少um的滤网过滤呢？貌似很难过滤呢，粘粘的

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作者: xuzhijuan1989    时间: 2012-11-28 22:17

回复 king8 的帖子' O8 A. [) S  ~5 Z2 u
' e( ~( h3 }+ }9 I* _  q
你好，能请教下你的酶解法是怎么做的吗？具体的操作方法怎么做呢？酶要消化多久，用什么过滤，消化之后的液体貌似很粘，不好滤过，请问有什么办法可以解决，谢谢啦！

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作者: 细胞海洋    时间: 2012-11-29 10:11

回复 xuzhijuan1989 的帖子- m5 V4 n* e4 c% [% b
4 ?7 q+ g: N, \: X9 N9 z& \) @
建议你发新帖提问

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作者: yanwu_1    时间: 2013-1-8 10:37

酶法和组织块法的最大区别，应该是成功率吧。酶法的成功率不稳定，消化的好，2-3天就传代，很多时候都没有细胞。组织块法成功率九成以上。

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作者: deshenglll    时间: 2013-1-8 10:43

组织贴壁法比较方便，成本较低。适用于大规模生产。酶消化操作时间较常，成本高，更适用于科研。

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作者: bings214    时间: 2013-2-16 21:33

回复 yanlu98 的帖子
$ N8 G4 q; }8 k9 B2 a1 K7 P
1 L0 N# H6 i0 ^. j1 X0 N6 [但是酶消化法，细胞的生长率不佳吧，有些经过胶原酶消化后都没有细胞生长的。你做的情况是怎么样呢？

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作者: 湖南干细胞    时间: 2013-2-17 08:52

回复 单个核细胞 的帖子$ v2 q5 i* r1 C8 V$ E

) t' {. e; i. v2 X2 D- C, ?9 U. S' k请问那种能在离心管里剪碎组织块的剪刀全名叫什么，规格是？

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作者: 湖南干细胞    时间: 2013-2-17 10:23

回复 哇牛 的帖子
( J1 V- K7 Y) q4 }4 B
; P! J% }! K5 c1 `7 b! ]这篇文章我在PUB上没看到，请问可以上传看看不？

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作者: 孙帅帅    时间: 2013-2-17 11:25

个人认为贴壁法比较好掌握，养出来的细胞也不错。
" ?/ e. i( }0 U+ o: l5 V: I9 U（1）、去除脐带动脉、静脉和脐带粘膜，分离华通氏层，剪成1mm3的小块。在剪切过程中可以适当的加几滴培养液以保持细胞湿润。" @( {+ g# [4 z( J0 b& m. H. N
（2）、将组织小块平铺在培养瓶底部，间隔5mm左右，放置2~4小时后，加少量培养基培养（加入的培养基最好刚刚没过组织块）加入培养基时动作尽量要轻，不要让组织块漂浮！

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作者: 单个核细胞    时间: 2013-2-17 12:13

回复 湖南干细胞 的帖子0 g7 `9 ^1 }8 h
* X. b" v2 L4 ]  G
组织剪，弯头，16cm

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作者: 单个核细胞    时间: 2013-8-14 09:58

* L4 g. ~% Q/ r

" x$ C' d. h1 \0 W" o回复 willow0711 的帖子
- ^9 O! J; x' t4 Z" C+ v2 u6 v* e6 A5 o- ^( U% P7 l
邮件已发送，请查收。也可通过下面的链接下载。% a# g% q2 I3 X5 ]/ d

, f. K  q7 F0 F) Z( f3 ~下载地址：点击这里

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作者: willow0711    时间: 2013-8-14 10:04

回复 单个核细胞 的帖子
9 \# {4 n" E9 ?: F% A$ {8 L" X. B; S) E# P& N3 n
哦，我看到文章了，谢谢你！

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作者: ytumuyangren    时间: 2013-8-26 16:26

回复 askage 的帖子
1 N0 R. S, B! p5 v$ Y1 p. v) @
5 z. |2 j& e7 w7 l+ K5 V. U您好！我采用胶原酶II消化华通氏胶，得到的液体很粘稠，过滤十分困难，即使过滤过去的液体，在离心的时候仍然得不到沉淀。不知您有没有遇到过 这样的问题，或者说您在消化结束后是怎么操作的。谢谢，期待您的回复。

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作者: cloud100    时间: 2014-7-29 02:17

8 }  U7 ]% `  q: {" @1 I+ q

- r8 @- @: H# M5 h% p5 b回复 哇牛 的帖子
7 [0 N! v5 @! J2 h+ x
; u  N+ Q+ d& p  P. g: r您好，这篇文章PUB是要收费的，我们学校没有账号，下载不了，请问可以发给我看一下吗？- P2 [% h& G/ R, q. q$ m+ O
、

---

作者: hameln    时间: 2014-7-29 11:25

图的裂的 图片也不能下载

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作者: 细胞海洋    时间: 2014-8-4 17:55

回复 cloud100 的帖子
5 w* |- v% g+ \" w! u. Y3 v3 A1 n+ c, n0 n/ T' N
文献互助区 求助

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作者: 单个核细胞    时间: 2014-8-5 09:33


0 `+ Q* j8 h* o7 q! N, Y4 y

单个核细胞 发表于 2012-1-4 09:20
  A# Y" o, }4 |8 o, V5 O9 c回复 哇牛 的帖子

1 k/ }0 C) b# p6 j, B/ K+ S( K* ~1 g" G* _8 L! b" U$ q* N  }- g4 b
补充图片及文献：% _7 c' }: m  S* S) ]

$ {( E2 u7 k1 P+ q. X- H  h[attach]63187[/attach], E, [2 c9 R! t8 B1 g: q6 s/ F
% ~8 f1 p; I* t1 Z$ C4 `' r0 s
[attach]63188[/attach]
2 M" T" d* s1 U9 v# D4 s% {
! t8 \3 O9 `3 }7 u' O[attach]63189[/attach]
5 G/ @. S6 k: c9 h5 T# n$ F
' E- w! Q0 |% A/ @7 Q9 @, ]! E另，细胞照片：/ g4 V/ I* q5 T( M0 z* N7 s
6 c9 f1 e& @6 h* U. v; a
[attach]63178[/attach]
: u( p( Y! u  x
: ?8 O! j3 h4 k3 z8 z4 d* ~0 u, p[attach]63179[/attach]7 ]. a' T" q* b' _" a9 e; I
# d- d, y3 d0 S8 p
[attach]63180[/attach]
' l3 p! p, x0 ^2 @" T8 D8 d9 Q: |/ W, b& Y
[attach]63181[/attach]2 b( N% w7 M7 O

3 E2 g* }5 B! @+ [* Q[attach]63182[/attach]
& D. x& o# X% ?' e, w0 W. t' T0 C& c
[attach]63183[/attach]
7 m1 Y; j! c% d" ^  E. I" c) x2 \% O; ]7 V2 H$ F5 d
[attach]63184[/attach]- H& @" m& L( N/ r! Q
* @( o1 \; ^3 b& A
[attach]63185[/attach]
) s. x% v2 I) G' ]/ ]7 O: b( ?( U
. Z8 l, ~6 q) h5 m6 E# L[attach]63186[/attach]2 t! ]- M, |" D" l- ~
" I' @; Z. X4 t/ q
[attach]63195[/attach]8 U( x0 X; J, f4 F: D
' @7 o  b) Y2 R. O/ X1 u
另，推荐阅读：: Z& N( x- Z* e- J/ }8 k
, {% U% n% R2 @! t+ z2 z

• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：
• 请教华通氏胶的剥离：
• 应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞：
• 脐带间充质胶质的备置：
• 脐带间充质细胞贴壁法出芽率怎么这么低：
• 脐带间充质贴壁法到底几天换液：
• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?
  3 \+ |( R: Z9 {" }

0 U" @. D1 f0 M6 h* S

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作者: 小样    时间: 2014-8-7 16:51

我们一直是贴壁法，做得很好的。

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作者: 严杰    时间: 2014-8-14 19:27

贴壁法简单易行，无酶作用。

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作者: yongganyixie    时间: 2014-8-18 15:13

回复 哇牛 的帖子2 |( V) s& ?: O
) z1 Z, Z3 M# S- q+ B
我们两种都做过，酶消化法得到的结果不是很理想，还不知道是什么原因，现在都是用组织块贴壁法，效果还不错

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作者: 2013sp    时间: 2014-8-25 09:42

回复 yanlu98 的帖子! S) e2 [- `" G3 s- A6 u

0 i- R4 Q: M: e4 i9 n我使用贴壁法一直未得到足够的脐带间充质干细胞，故求酶消化法步骤，跪求！！！非常感谢！！！

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作者: 细胞海洋    时间: 2014-8-26 08:45

回复 2013sp 的帖子5 k5 r( T4 Y* \9 j) u
- d) \0 c3 T+ ?& C6 g2 J; O, V
建议你发新帖提问

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作者: 罗裙漫紫蝶香    时间: 2016-5-19 11:22

回复 单个核细胞 的帖子. y% M8 S; _7 O* b  F+ U/ ]( O$ g
. {) e, Q1 _, f9 D% I. S. i6 }
图片看不了呢，捉急# Z$ H8 u' [& m' _+ f" c- `

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作者: shuimiao327    时间: 2016-5-20 11:28

用组织块贴壁法，没用过酶消化法，贴壁法操作简单，酶消化法会对细胞造成伤害

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作者: Diane0321    时间: 2016-5-20 16:51

- x. E  I  _6 N. ?3 y, u) s$ g
组织块培养法：将剪碎的组织块均匀铺于六孔板中，间隔1-3mm即可，倒置六孔板中，放入孵箱1.5h左右取出，见组织块已经粘附在培养皿底部，延边缘缓缓加入培养基，注意一定不要将组织块冲起，要让培养基逐渐蔓延整个培养体系，放入培养箱，3d后上镜看，如果有细胞沿组织块边缘出现后可以间隔3天换液了，等到组织块周围细胞呈集落生长，可以传代了。
; n$ `, \0 W- N, l6 [1 t  Z/ b

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作者: 晗晗    时间: 2016-5-23 09:34

我觉得贴壁法挺好的,反正各有各的好处,酶消化法时间短,但是如果你没消化好就完啦,贴壁法比较慢,但是效果挺好的,你要总注意观察细胞,即时缓缓培养液什么的

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作者: shuimiao327    时间: 2016-7-19 16:55

酶消化法操作复杂，对细胞会造成损伤，贴壁法相对操作简单，容易上手，效果好

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作者: ltickp    时间: 2016-10-20 15:49

给别人治疗保健，我们这儿用的是酶消化法，基本一周可获得原代细胞，P1之后基本4天可以长满100mm的皿

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作者: kiss2346    时间: 2016-10-22 14:08

酶消化法养脐带间充质还真没做过，不过个人感觉还是组织块贴壁法 好做一些，  操作简单 省心 初期稍微慢一些，传代之后生长速度还是很给力的，分离技术好的话P1代就可以很纯的

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作者: lyj-0017    时间: 2017-4-16 10:59

回复 ltickp 的帖子2 R' _5 G+ g* O) W
# C5 y; k6 O2 G& W6 J, l
你好，同学。请问你的酶消化法用的是什么酶？浓度有多大？需要消化多长时间呢？消化过程中有什么需要注意的呢？谢谢了！

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作者: 晗晗    时间: 2017-4-17 10:58

消化法和组织块法各有各的优缺点：  m/ c+ I" Y+ X( s
消化法：6 [. \5 M0 @) \5 Y8 Z/ {
1.细胞长得快，细胞比较纯
4 K: F4 m# L% x% ]2.成本高一些
5 R3 r5 R' O& K# q组织块法：+ `9 g# _* v9 `% f- u* l  \
1.成本低4 \' p5 H. H, G0 ^% P
2.细胞长得慢，不纯: Y/ k1 x+ C! ~( Q( ~7 y
但是如果是新手建议用组织块法，因为刚开始掌握不好消化时间，容易消化的不好影响细胞以后的生长

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作者: 毛球    时间: 2017-4-17 15:46

个人感觉酶消化法比较方便操作，容易形成大规模生产。

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作者: 444352110@qq    时间: 2017-5-16 11:29

组织贴壁法是比较耗时，能否告知下在让组织贴壁时，加培养液是多少？加多少比较合适，如果量过少，会不会导致组织块失去水分？! d- l' q3 i1 y

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作者: 细胞海洋    时间: 2017-5-16 19:52

回复 444352110@qq 的帖子( g* Q: P% ~/ F4 U

  |3 B( W5 d" l$ Z& v2 B建议你发新帖提问

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作者: yanxm920    时间: 2017-5-18 13:47

肯定是贴壁法好得多啊，酶消化法影响细胞的增殖活性和细胞的纯度及表型。

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