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标题: 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法 [打印本页]

作者: 哇牛 时间: 2012-1-1 15:30 标题: 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法

看文献说脐带间充质干细胞有两种分离方法：酶消化法和贴壁法不知道哪位大侠用过贴壁法，效果咋样？

作者: king8 时间: 2012-1-1 22:43

的确是有两种方法，
两种方法都做过
各有优缺点1 T* s! a# d2 j0 e7 j; C
1 酶消化法
优点：时间短    细胞状态好  0 Y* V. i4 ]  q9 z4 e) I( ~
缺点：操作复杂费用高9 V' @: N& i& n% N$ n
2 贴壁法. ^: [; p# A8 i/ i' @
优点：操作简单  省钱
缺点：时间长    细胞可能不纯7 c5 S, ~: ^) G: k+ r7 ^; S7 g& p# k
仅供参考

作者: NK细胞 时间: 2012-1-4 08:27

作为养干细胞的新手，我只知道酶法，不知道贴壁法，求学习！

作者: 单个核细胞 时间: 2012-1-4 09:20

本帖最后由细胞海洋于 2012-1-5 00:50 编辑 ; d+ L1 s. j9 r5 n3 ^+ d
1 L4 J5 M8 g) @* ?9 S+ C
回复哇牛的帖子0 D# w. Z. p$ }6 l

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作者: sanfa 时间: 2012-1-4 12:33

楼上给的很详细给力啊

作者: andreqin 时间: 2012-1-4 15:06

个人认为组织贴壁法比较好操作，而且后期传代培养很不错

作者: suning5 时间: 2012-1-5 09:00

目前，临床治疗的生物公司，大多是用的组织贴壁法。细胞状态很好。获得量也很大

作者: askage 时间: 2012-1-5 10:53

消化法：如果不采用胰酶，仅用胶原酶，原代可以很快培养出细胞，我们最短的4天就养出了原代细胞【细胞上百万】，而且细胞的性能也很不错。采用胰酶后，细胞的性能会受一些影响。这个是文献说的：对组织处理越多，细胞受到得伤害就越大，不处理最好。所以组织块法养出的细胞性能最好。就是养的时间长，有一定杂细胞，传代后可逐步纯化。

作者: 2008dentist 时间: 2012-1-5 11:00

个人实验经验认为，做脐带干细胞贴壁法成功率高，且所获得细胞较均一，利于后期挑单克隆等。

作者: 荷荷 时间: 2012-1-6 09:10

如果要用于临床的话，个人感觉还是贴壁法好一些，成本低，外源因子引入的也少

作者: deshenglll 时间: 2012-1-6 16:24

个人认为组织块法比较好。酶消化时间比较长。且对细胞有伤害。

作者: xiaolong 时间: 2012-2-15 13:07

贴壁法，顶一个，不错

作者: xylophone 时间: 2012-2-15 13:33

回复单个核细胞的帖子! D6 H2 G: `% a' a
5 J( j: N5 p; ^6 A% Z) q* L: v
请问你图片上的第一张2cm脐带的图是去除了外膜的吗？+ U* p5 x8 ^: ~! p
血管切除时血管上会粘有很多华通胶，而最后得到很少的华通胶怎么办

作者: crazytime 时间: 2012-2-15 23:53

有文章比较过两种方法，组织块贴壁法获得的细胞比较均一，但是时间长，可惜自己没有比较过这两种

作者: 哇牛 时间: 2012-2-21 21:17

Method to Isolate Mesenchymal-Like Cells from Wharton’s Jelly of Umbilical Cord
大家可以看下这篇文章，有详细的步棸及图片说明

作者: yanlu98 时间: 2012-2-22 09:02

个人感觉贴壁法太慢了！我曾经贴壁和酶同时做，酶消化的都第二代了，贴壁法才刚刚可以传代，也有可能是我自己没有处理好，虽然原代处理的时候贴壁法的确没有多少成本，但是它的周期长，在这过程中又要不停地换液，还是要成本，所以我现在都用酶消化了。

作者: yanlu98 时间: 2012-2-22 09:21

以前我同时做过贴壁法和酶消化法，贴壁法的周期太长了，当酶的已经传到第二代时，贴壁法还不能传代，虽然贴壁法原代处理时不需要多少成本，但是由于培养周期太长，期间要不停的换液，所以消耗的培养基也多，所以现在我一般都用酶的。

作者: brian111 时间: 2012-2-22 09:42

回复 king8 的帖子( \$ a. u; v6 M) H% X

这位兄台，不知道你说的机械法纯度不高是怎样一个标准？我没做过酶消化，只做过机械法。我们用的流式测纯度能到98左右，当然只是流式结果，其他的方面没有做。不知道酶消化能多高？还有有人说酶消化由于有化学物质，可能对细胞有损伤，你觉得有影响么？仅从细胞状态来说，这两种方法哪个更好些？

作者: shizhu198511 时间: 2012-2-26 10:58

我酶消化法和组织块法都做过，酶消法快呀，1天就见到细胞贴壁，1周左右就可以传代，组织块最少7天才有细胞迁移出，传代最少要1月，我推荐酶消化法用的胶原酶2（浓度1mg/ml),消化4小时就可以了

作者: xiaolong 时间: 2012-2-26 11:29

用过贴壁法，没用过酶消化法，所以没有比较过两者的效果哪个更好。不过对于贴壁法的看法，还是比较赞同“六楼”andreqin 的看法的。

作者: xiaolong 时间: 2012-3-16 12:55

回复单个核细胞的帖子
4 L% u" }) T D+ `' d
接种后，组织块有个贴壁的环节，贴壁效果好的，加培养液后，细胞会爬的很好，如果贴壁效果不好，组织块会漂在培养液里，细胞爬的效果很差，怎样能让组织块很好的贴壁？贴壁时间多久再加培养液会好些呢？

作者: 单个核细胞 时间: 2012-3-16 16:32

回复 xiaolong 的帖子; u5 y( C9 |' m8 p/ @+ n* ]* }
& n1 U0 y; ]( }( e; b# E( J# f
剥胶的时候，剥下来的华通胶直接放在50ml离心管内，全部剥完后剪碎，剪的过程中如果太黏，可以滴加少量PBS，不要滴太多。贴壁的时候用3ml吸管吸起组织，接种在培养瓶中。T75培养瓶每瓶贴20-25块，在培养箱中放置3-4小时后补加适量完全培养液。若是做的晚，可以第二天早上加液。以后观察的时候动作要轻盈，尽量不要使组织块漂起。7-10天后，会有细胞爬出，可以去掉组织块补加新鲜培养液继续培养，等到局部间充质干细胞密集的时候，可以传代。

作者: xiaolong 时间: 2012-3-17 09:53

回复单个核细胞的帖子4 F6 s' c! u! T6 }7 v0 O! T

谢谢啊！

作者: xiaolong 时间: 2012-3-17 12:21

回复单个核细胞的帖子

再问，“在培养箱中放置3-4小时后补加适量完全培养液。若是做的晚，可以第二天早上加液”，如果组织块在培养瓶中贴壁，组织块在培养瓶中裸露的时间太久了，是不是会影响组织细胞的活性？

作者: 单个核细胞 时间: 2012-3-19 09:39

回复 xiaolong 的帖子
7 ~ K& }" a9 ~* |7 [
过夜我做过多次，没发现对细胞活性有影响。你也可以这样，刚贴完壁在每个贴壁的组织块上滴加一滴完全培养液，保持湿润就行，放置的目的主要是让组织块贴壁牢固，加入培养液后不至于漂起来。

作者: xiaolong 时间: 2012-3-20 17:26

回复单个核细胞的帖子9 S `& ^. U! D9 u8 d: `0 j$ g

再谢谢啦

作者: Demon_CN 时间: 2012-3-23 12:27

酶消化法比贴壁法细胞长的快，生产周期短，但是消化法技术要求高，消化时间掌握比较重要消化过度会伤细胞( ^9 E8 T) i/ N/ G# a
操作发杂一点，费用也要贵一点。
贴壁法，比较简单，但是周期长一点，我现在就用大概P1代冻存有10*7个细胞（养5个T75，传代一次）。缺点你懂的周期长。

作者: xuyang0317 时间: 2012-4-19 17:55

个人觉得，贴壁法很好，速度经济，省钱省力省时，就是培养的时间要长点，爬片时注意不要污染，成功率是100%

作者: xuyang0317 时间: 2012-4-19 18:52

你可以先加5分之一的培养液，第二天再补上，没问题的，我做过！

作者: hyf198675 时间: 2012-5-3 19:16

回复 askage 的帖子' j2 [: `+ i% W r

你能不能和我说下你们的实验步骤啊？我正在做酶消化法培养间充干，但培养效果不好，拜托了！

作者: xuzhijuan1989 时间: 2012-11-28 22:14

回复 askage 的帖子2 c* H$ m& F! | M6 O

你好，请问你用酶解法分离过期待MSC吗？具体怎么操作呢？胶原酶消化多久啊？用多少um的滤网过滤呢？貌似很难过滤呢，粘粘的

作者: xuzhijuan1989 时间: 2012-11-28 22:17

回复 king8 的帖子# L+ {& r2 z/ M8 L) d! o9 z- Z

你好，能请教下你的酶解法是怎么做的吗？具体的操作方法怎么做呢？酶要消化多久，用什么过滤，消化之后的液体貌似很粘，不好滤过，请问有什么办法可以解决，谢谢啦！

作者: 细胞海洋 时间: 2012-11-29 10:11

回复 xuzhijuan1989 的帖子! x8 Y/ G0 b5 P2 j

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作者: yanwu_1 时间: 2013-1-8 10:37

酶法和组织块法的最大区别，应该是成功率吧。酶法的成功率不稳定，消化的好，2-3天就传代，很多时候都没有细胞。组织块法成功率九成以上。

作者: deshenglll 时间: 2013-1-8 10:43

组织贴壁法比较方便，成本较低。适用于大规模生产。酶消化操作时间较常，成本高，更适用于科研。

作者: bings214 时间: 2013-2-16 21:33

回复 yanlu98 的帖子+ J- f0 q9 I9 M3 c. ^* H

但是酶消化法，细胞的生长率不佳吧，有些经过胶原酶消化后都没有细胞生长的。你做的情况是怎么样呢？

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-17 08:52

回复单个核细胞的帖子

请问那种能在离心管里剪碎组织块的剪刀全名叫什么，规格是？

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-17 10:23

回复哇牛的帖子1 E! `$ u+ k2 s2 l U- J/ ], b

这篇文章我在PUB上没看到，请问可以上传看看不？

作者: 孙帅帅 时间: 2013-2-17 11:25

个人认为贴壁法比较好掌握，养出来的细胞也不错。9 |; S: C" ~* `; {; D% S" s& }
（1）、去除脐带动脉、静脉和脐带粘膜，分离华通氏层，剪成1mm3的小块。在剪切过程中可以适当的加几滴培养液以保持细胞湿润。' N1 w: I E; C0 u; E, w1 O& \( O; q
（2）、将组织小块平铺在培养瓶底部，间隔5mm左右，放置2~4小时后，加少量培养基培养（加入的培养基最好刚刚没过组织块）加入培养基时动作尽量要轻，不要让组织块漂浮！

作者: 单个核细胞 时间: 2013-2-17 12:13

回复湖南干细胞的帖子
2 Z% O# i- o3 L" N- L
组织剪，弯头，16cm

作者: 单个核细胞 时间: 2013-8-14 09:58

本帖最后由单个核细胞于 2013-8-14 10:00 编辑

回复 willow0711 的帖子

邮件已发送，请查收。也可通过下面的链接下载。

下载地址：点击这里

作者: willow0711 时间: 2013-8-14 10:04

回复单个核细胞的帖子
0 P4 a V ?+ P7 ?) N1 H I+ @
哦，我看到文章了，谢谢你！

作者: ytumuyangren 时间: 2013-8-26 16:26

回复 askage 的帖子
; n& {! ^, H( R+ c$ \8 l% d
您好！我采用胶原酶II消化华通氏胶，得到的液体很粘稠，过滤十分困难，即使过滤过去的液体，在离心的时候仍然得不到沉淀。不知您有没有遇到过这样的问题，或者说您在消化结束后是怎么操作的。谢谢，期待您的回复。

作者: cloud100 时间: 2014-7-29 02:17

本帖最后由细胞海洋于 2014-8-4 17:54 编辑
2 D( [0 c/ Y! |# O: \; L' q) s
回复哇牛的帖子; D4 ~( S8 g: H6 z1 H" x. m+ R

您好，这篇文章PUB是要收费的，我们学校没有账号，下载不了，请问可以发给我看一下吗？
、

作者: hameln 时间: 2014-7-29 11:25

图的裂的图片也不能下载

作者: 细胞海洋 时间: 2014-8-4 17:55

回复 cloud100 的帖子

文献互助区求助

作者: 单个核细胞 时间: 2014-8-5 09:33

本帖最后由单个核细胞于 2014-8-5 09:46 编辑

单个核细胞发表于 2012-1-4 09:20 ) _1 f1 P4 ^3 {% ?* U: j% o
回复哇牛的帖子

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& Z+ Y, S% A& k8 u% F" W
补充图片及文献：0 ?- I* `; m+ K$ m+ z
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2 x- ?* T, a" V5 g" y1 p
[attach]63188[/attach]& @3 a8 n  u/ a2 w
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[attach]63189[/attach]" G8 M" i5 Y$ e* }! \0 ]. E
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另，细胞照片：
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* G1 }5 ?' {: C0 ^% s' a
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1 \9 }$ \+ l7 W: D
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另，推荐阅读：
9 Z; g8 x1 @. D/ z) `

9 W1 ^3 |9 ?& p% z& [+ `1 }& x# \

作者: 小样 时间: 2014-8-7 16:51

我们一直是贴壁法，做得很好的。

作者: 严杰 时间: 2014-8-14 19:27

贴壁法简单易行，无酶作用。

作者: yongganyixie 时间: 2014-8-18 15:13

回复哇牛的帖子' z0 P" e6 _; @* P1 ?6 d7 j2 }% G
; u n: S- ^. j3 C2 `& @
我们两种都做过，酶消化法得到的结果不是很理想，还不知道是什么原因，现在都是用组织块贴壁法，效果还不错

作者: 2013sp 时间: 2014-8-25 09:42

回复 yanlu98 的帖子
1 X O* Y; g: J
我使用贴壁法一直未得到足够的脐带间充质干细胞，故求酶消化法步骤，跪求！！！非常感谢！！！

作者: 细胞海洋 时间: 2014-8-26 08:45

回复 2013sp 的帖子

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作者: 罗裙漫紫蝶香 时间: 2016-5-19 11:22

回复单个核细胞的帖子

图片看不了呢，捉急( p& [7 B0 M0 j d8 U- j4 Y+ R0 S

作者: shuimiao327 时间: 2016-5-20 11:28

用组织块贴壁法，没用过酶消化法，贴壁法操作简单，酶消化法会对细胞造成伤害

作者: Diane0321 时间: 2016-5-20 16:51

0 q3 j% n- J& X4 }& k. u
组织块培养法：将剪碎的组织块均匀铺于六孔板中，间隔1-3mm即可，倒置六孔板中，放入孵箱1.5h左右取出，见组织块已经粘附在培养皿底部，延边缘缓缓加入培养基，注意一定不要将组织块冲起，要让培养基逐渐蔓延整个培养体系，放入培养箱，3d后上镜看，如果有细胞沿组织块边缘出现后可以间隔3天换液了，等到组织块周围细胞呈集落生长，可以传代了。% Z6 F( k/ U4 g2 a; R

作者: 晗晗 时间: 2016-5-23 09:34

我觉得贴壁法挺好的,反正各有各的好处,酶消化法时间短,但是如果你没消化好就完啦,贴壁法比较慢,但是效果挺好的,你要总注意观察细胞,即时缓缓培养液什么的

作者: shuimiao327 时间: 2016-7-19 16:55

酶消化法操作复杂，对细胞会造成损伤，贴壁法相对操作简单，容易上手，效果好

作者: ltickp 时间: 2016-10-20 15:49

给别人治疗保健，我们这儿用的是酶消化法，基本一周可获得原代细胞，P1之后基本4天可以长满100mm的皿

作者: kiss2346 时间: 2016-10-22 14:08

酶消化法养脐带间充质还真没做过，不过个人感觉还是组织块贴壁法好做一些，操作简单省心初期稍微慢一些，传代之后生长速度还是很给力的，分离技术好的话P1代就可以很纯的

作者: lyj-0017 时间: 2017-4-16 10:59

回复 ltickp 的帖子
+ \2 r, B' h2 K( _ Q( q
你好，同学。请问你的酶消化法用的是什么酶？浓度有多大？需要消化多长时间呢？消化过程中有什么需要注意的呢？谢谢了！

作者: 晗晗 时间: 2017-4-17 10:58

消化法和组织块法各有各的优缺点：/ b5 Y w& g! L; s2 _9 y! L p9 Y
消化法：
1.细胞长得快，细胞比较纯# b4 e/ q4 m& {
2.成本高一些7 h" X) D {8 Z- }5 o5 L
组织块法：
1.成本低0 E4 X8 X1 O5 ^2 E9 ]! _3 s4 X0 j. {
2.细胞长得慢，不纯
但是如果是新手建议用组织块法，因为刚开始掌握不好消化时间，容易消化的不好影响细胞以后的生长

作者: 毛球 时间: 2017-4-17 15:46

个人感觉酶消化法比较方便操作，容易形成大规模生产。

作者: 444352110@qq 时间: 2017-5-16 11:29

组织贴壁法是比较耗时，能否告知下在让组织贴壁时，加培养液是多少？加多少比较合适，如果量过少，会不会导致组织块失去水分？

作者: 细胞海洋 时间: 2017-5-16 19:52

回复 444352110@qq 的帖子( u/ V1 R8 I/ R$ L, ^* a; [* I# L
0 P' v# G* G- A2 Z
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作者: yanxm920 时间: 2017-5-18 13:47

肯定是贴壁法好得多啊，酶消化法影响细胞的增殖活性和细胞的纯度及表型。

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