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标题: 脐带组织块贴壁法求助 [打印本页]

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-2 22:42 标题: 脐带组织块贴壁法求助

本帖最后由湖南干细胞于 2013-2-2 23:02 编辑 . P: P0 O$ X5 ~. x

将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。! |, h2 i; c8 V
剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；9 t" J0 \% n8 R  i0 R& z
5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。2 g2 H1 ~( Q" w7 ~  V# j
以上是我的组织块贴壁法，请教：: _6 ~2 V$ l: D" [
①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？( \9 c* b5 j  D0 D
②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?4 y+ P0 |* i" ~$ {' ]
③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。$ m/ r: |& E  k- n4 e
剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？
用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,& r+ y: Y  d5 ^
以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

作者: 老姜 时间: 2013-2-4 11:26

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-4 11:43

本帖最后由湖南干细胞于 2013-2-4 11:48 编辑 0 x8 E* E5 j: L

回复老姜的帖子) P8 N; _3 ^, Q6 x
^" I% P1 d% N, d) y# v! f* A% e( B
[attach]49382[/attach][attach]49382[/attach]/ U. m! b. P7 |/ b7 L- k& w, v
这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。
需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。1 j( J0 E5 E' S4 O' t5 B
离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

作者: ruofan1982 时间: 2013-2-4 13:31

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。* D, z. T: B2 w9 M' T
0 J( S2 P" K; n- X3 j

作者: ruofan1982 时间: 2013-2-4 13:32

湖南干细胞发表于 2013-2-4 11:43
3 z# ]* J- i0 ?" c1 u: @ e7 v回复老姜的帖子

你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

作者: 小冬子 时间: 2013-2-4 14:44

同意楼上，建议用10cm的培养皿
先剪成条儿，再剪成小块儿
要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起) ~* [8 Z0 J: p0 l
直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

作者: dongxin 时间: 2013-2-4 15:37

回复湖南干细胞的帖子

1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。7 n( E( X. S M# Y
2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。
3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）) T- U1 d" M1 l3 }
4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。 V, d( ~# `0 W6 o5 ?
供参考，祝好运！

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-4 16:05

回复 ruofan1982 的帖子0 S% I7 D9 n/ u
4 B9 z: Q' R! l, L
需要倒置贴壁吗？

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-4 16:08

本帖最后由湖南干细胞于 2013-2-4 16:10 编辑

回复 dongxin 的帖子: ]2 S6 k `3 E3 R/ Q7 ?6 b
3 \4 ]! p1 {& n- A7 z
谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

作者: 老姜 时间: 2013-2-4 16:49

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！

作者: 老姜 时间: 2013-2-4 16:54

从你照片上看你养的细胞不像污染，好像组织块不太均匀，接种后再摇摇，尽量铺均匀点。不换液时不要动培养器皿，利于细胞贴壁。

作者: dongxin 时间: 2013-2-5 08:52

回复湖南干细胞的帖子3 |+ ^. L( g# k/ k( I

用PBS洗，然后种块，个人觉得“倒置”影响不大，我试过倒置和不倒置，都一样爬细胞。供参考

作者: jxydiandian 时间: 2013-2-5 09:08

建议：1.剥脐带前先用75%的酒精将脐带泡3-5min，目的是软化脐带外面的一层薄，然后将膜撕去，这样在后面剪组织块的时候才能剪得更碎。
      2. 你的组织块太大了，而且剪得时间也太长，操作脐带的时候注意不能让它太干了。9 c% S4 @) A0 s/ l8 G8 @- ~
      3.组织块剪好后加培养基混匀贴壁即可，不用像你上述的那么麻烦。放进培养瓶后不要老动它，不然组织块不贴壁，就没法爬出细胞。" ~, }$ A9 j  l7 F8 I! `
      4.培养基的量以使组织块能贴到壁，但又不能太少，否则很容易就干在上面了。
小小建议，仅供参考。

作者: newjack920 时间: 2013-2-5 10:49

本帖最后由 newjack920 于 2013-2-5 11:13 编辑

同意楼上的建议，脐带先用75%酒精浸泡洗3-5min，然后剪取脐带中间三段，每段约2-3cm（看你需要多少细胞了，要的多就多剪几段）移到10cm一次性平皿中用生理盐水清洗血迹等，然后再另一平皿中分离华通氏胶，2根动脉，1根静脉去除，然后就是剥胶，脐带外膜不要。将分离下来的华通氏胶转移至50ML离心管中剪碎，各种文献上都说要剪碎至1MM3，但这不是很好做到，大概就行，别太大，1-3MM3都行的，剪碎后加培养液至离心管，混匀后直接接种，一般剪3段2-3CM的脐带，我们实验室都是接种到3个T75瓶中，隔3天换液，大约10天细胞达50%以上

作者: 猩猩 时间: 2013-2-5 12:19

建议你的组织块再剪小一点，不要太小，免得影响贴壁，还有你培养瓶的组织块量有点大，没有留出足够的空间给细胞爬出，还有哦，你在剥离血管时可以不剪开静脉，从而可以剥除整个静脉腔，这样也可以减少操作时间和污染率哦。 “注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好”你这一步会增加细胞污染率

作者: lazyworm 时间: 2013-2-6 10:31

剪得太大，工欲善其事必先利其器，一定要选择好剪刀，弯剪比较好剪。接种的太密了，75cm2的瓶子一般种0.5g到0.8g。培养基的量也不能加太多，以免不好贴壁。有时候胶水肿了，会发黄或者透明。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-6 16:21

回复 lazyworm 的帖子3 G2 J- K3 ~$ u7 t1 g
: c( B) _3 I* A
好的，以后选择弯剪刀试试。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-6 16:29

回复猩猩的帖子2 |, E7 \ g; S
8 Q! f" {+ U) Q V. h) G
好的，以后直接剥离静脉看看。尽量减少污染。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-6 16:36

回复老姜的帖子. m0 D E0 w* g$ C1 `& j9 [

[attach]49453[/attach]4 S2 {1 w' Q, g" i5 ] S
谢谢指点，这是接种第5天我拍摄的照片，上面的是间充质不。这种情况下可以换液了不？

作者: 孙帅帅 时间: 2013-2-6 16:38

1、组织剪切的过程可以适当滴加1~2滴培养液以保持湿润；
2、如果组织不易贴壁生长最好把培养瓶底部加几滴薄层血清或者鼠尾胶原；. j/ C1 Z6 o4 x1 Q6 E9 X
3、每小块间距5mm左右，最好不要贴在一起；8 Z w$ z# H' I0 e1 Y2 L
4、组织块也可不用翻转法，即在摆放组织快后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放入培养箱中培养4~24小时后再加培养基培养。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-6 16:56

多谢大家的指点，我一定继续努力。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-6 17:00

回复 jxydiandian 的帖子7 F6 A; D8 a9 ^ j/ _1 a
. p& c4 x* B* P0 S' Q/ |
谢谢，我尽量加快速度。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-6 17:36

回复孙帅帅的帖子

我也试试加点血清看看贴壁效果会不会更好。

作者: 孙帅帅 时间: 2013-2-6 21:39

如果你是做科研，在贴壁之前涂薄层血清就行，但是如果你做生产就不用了，生产要节约成本啊，其实间充质干细胞很容易贴壁的！

作者: 老姜 时间: 2013-2-8 10:09

非常好！有大量细胞爬出，轻轻的从一个角吸出一半上清液，再在同处加入半量。不要再动三天后继续此法换液。这些中大部分是不贴壁细胞，过些天可在组织块周围见单个梭形细胞，其可大量增殖，是所要的间充质细胞

作者: 老姜 时间: 2013-2-8 22:19

19楼我上午给你发的回复你收到了吗？你的细胞样的正常了，要从皿的边上吸出半量，换液，再在同位置轻轻加入半量新鲜培养液，放入孵育箱中不要动，以后每三天按同法换液一次，10-15天在组织块周围可见单个散在的梭形细胞，这些细胞才是实验所需的间充质细胞，现在所见的大多细胞均是非贴壁细胞。

作者: 细胞海洋 时间: 2013-2-10 12:03

回复湖南干细胞的帖子( y5 e4 ~, R. W5 n9 K/ c7 V
" F0 P5 U+ h P" A2 Y$ v @
看26楼

作者: 细胞海洋 时间: 2013-2-10 12:06

回复老姜的帖子# @8 r) G/ o9 [. p
/ S0 D! O! y9 T
你回复谁就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容像我这样
7 d9 e- b8 `/ g6 Q) T' c( \+ I+ ~5 c
否则他会看不到

作者: 老姜 时间: 2013-2-10 16:29

回复细胞海洋的帖子

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-13 16:51

本帖最后由湖南干细胞于 2013-2-13 17:09 编辑

[attach]49517[/attach][attach]49516[/attach]回复老姜的帖子
8 ~: w" W- s* o. _
谢谢，有几天没上网了。很抱歉，当时没有看到回复，比较心急，2.8号那天，我去除了组织块，瓶底有很多白色物质，那时细胞还没有长出触角，后来细胞就不长了。2.11的时候，发现瓶底的白色物质溶解在培养液中了。
发现没什么细胞。[attach]49519[/attach][attach]49518[/attach]
是不是污染了？下次贴壁法去除组织块后，那些溶解的白色物质如何处理?

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-13 17:50

2.7日贴壁法养了脐带间充质，2.11日可见大量小圆形细胞，换液。2.12可见某角落有少量散在分布贴壁的细胞，求鉴定是否为间充质?

作者: 老姜 时间: 2013-2-14 17:59

回复湖南干细胞的帖子 L6 R, r) f9 P
" n' d- b$ b7 c1 M8 ]' d2 u4 {
污染了！细胞没伸出触角不能扔组织块！5 N( r: o" y* D# S) g0 Q
你最好改用培养皿培养好操作。组织块周围见有几十个、上百个细胞组成的集落后再将大的组织块用巴斯德吸管吸弃，碎的组织块不用管，换两次液就没了，即使有几个它也不影响细胞生长。最忌讳将培养器皿倾斜，使组织块流向器皿角落——将贴壁细胞擦脱落。白色物质是什么？不清楚。下两张图是污染了，弃之！

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-15 10:43

回复老姜的帖子
2 u; }/ h; H: e" S# c; I7 k) |8 d
谢谢指点，醍醐灌顶。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-15 11:10

回复湖南干细胞的帖子/ G9 X! [" S1 m( B0 X# T/ `
! z- E5 ]8 E9 u, N' H+ i. s
[attach]49536[/attach][attach]49535[/attach]以上是2.7号贴壁法培养的细胞，分别是2.12和2.11号的照片，请教是否为间充质细胞？谢谢。

作者: 老姜 时间: 2013-2-15 15:29

回复湖南干细胞的帖子

左图是间充质细胞，这时组织块还不要扔，等这些梭形细胞成集落状，但不能细胞和细胞接触——大量的细胞间接触，细胞会“老”！降低收获量——再扔组织块。
右图细胞爬出了，这种细胞中的绝大多数细胞不具有贴壁性，随换液会弃之，但贴壁细胞就在其中，不能摇动培养器皿，否则贴壁细胞不易贴壁或刚贴上被摇下来它不会再贴了。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-15 20:55

回复老姜的帖子

好的，我要再接再励。

作者: xiaoming210 时间: 2013-2-23 17:23

组织块铺在培养瓶上后倒置贴壁2个小时，两个小时后翻转，加少量FBS15%的培养基，浸没组织块即可，3天后首次换液，以后每3天半量换液一次

作者: 硕果累累_555 时间: 2013-2-23 21:24

1cm最适宜，要分布均匀，同时倒置培养，培养液不要过多，不过该法时间较长，不要乱动。

作者: 445334587 时间: 2013-2-28 14:17

回复湖南干细胞的帖子

剪的不是很碎，尽量剪剪，还有接种是要有间距，细胞生长不会重叠，而且观察也方便。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-28 15:26

回复 xiaoming210 的帖子
( ?- H b& z/ k
谢谢。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-2-28 15:27

谢谢各位指点。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-5 15:59

回复老姜的帖子
5 K, u- g: C0 Q7 {* H% a. v
[attach]49982[/attach][attach]49981[/attach][attach]49980[/attach][attach]49979[/attach]2.26日做了一次组织块贴壁法培养，12小时后添加培养液时就基本上漂浮了，但是还是爬出来很多细胞，3.2日1/3量换液，拍照如上1。3月5日，3月5日镜下观察基本上没细胞了，只有碎片照片2，培养瓶里的组织块全部都漂浮，部分发黄，培养液颜色变得很淡，后2张照片所示。& ~1 z C9 n1 X; \- N5 @+ X: o( _. ^) i
这次本来爬出很多细胞，结果还是细胞死亡了，是不是培养液换得不够，细胞营养不足？

作者: 单个核细胞 时间: 2013-3-6 14:47

本帖最后由单个核细胞于 2013-3-6 14:47 编辑 $ s: z) }- q0 ~1 _+ Q( U0 r4 [& a- B
! _. Y, X9 K0 J6 t4 `( }' {
回复湖南干细胞的帖子
7 |+ U$ n0 S5 s4 E: g
你确定有细胞从组织周围爬出吗？从你的描述以及照片加上时间推断，不大可能，你注意看一下是不是培养瓶底的东西，而不是你说的“爬出来很多细胞”。
* T) C- X* D: X8 T# r- {9 J1 Z
我这里附上一张组织周围爬出细胞的照片，如下图。9 g% q9 u4 B$ S

[attach]50001[/attach]

作者: 老姜 时间: 2013-3-6 15:59

回复湖南干细胞的帖子# ~7 ^# ~5 U% D* d( q1 j
' A5 v4 m, C4 L: O! A
照片1你组织块接种的太密，按这个浓度可以两盘种三盘。换液时要从皿边缘轻轻吸出，尽量不要倾斜培养皿，加液要一滴一滴的滴在大组织块上面（以免冲跑爬出的细胞），组织块一般在见到组织块周围有梭形细胞团时再挑出组织块（约10-15天），你下两张照片的组织块呢？这样即使见个别梭形细胞也会死掉的。

作者: 老姜 时间: 2013-3-6 15:59

回复湖南干细胞的帖子' p1 b+ E# u8 z& _9 Q- B

照片1你组织块接种的太密，按这个浓度可以两盘种三盘。换液时要从皿边缘轻轻吸出，尽量不要倾斜培养皿，加液要一滴一滴的滴在大组织块上面（以免冲跑爬出的细胞），组织块一般在见到组织块周围有梭形细胞团时再挑出组织块（约10-15天），你下两张照片的组织块呢？这样即使见个别梭形细胞也会死掉的。

作者: 老姜 时间: 2013-3-6 16:00

回复湖南干细胞的帖子
* ]1 Z6 ?: f" l& g, {( j# ]$ z5 o
照片1你组织块接种的太密，按这个浓度可以两盘种三盘。换液时要从皿边缘轻轻吸出，尽量不要倾斜培养皿，加液要一滴一滴的滴在大组织块上面（以免冲跑爬出的细胞），组织块一般在见到组织块周围有梭形细胞团时再挑出组织块（约10-15天），你下两张照片的组织块呢？这样即使见个别梭形细胞也会死掉的。

作者: 老姜 时间: 2013-3-6 16:02

回复湖南干细胞的帖子3 v% o. C) E! Z% \$ D9 i
0 B" V( a1 K7 b ]4 |( P( A0 S) `
43楼的细胞照片，梭形细胞长成大片了在右下角还见组织块了。你再细细琢磨琢磨。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-6 17:30

回复老姜的帖子

我的组织块贴壁不紧，9小时，第1次添加培养液时就基本上全飘了。后两张是爬出来的细胞，肯定不是皿底的东西，是爬出来的细胞，最一张是细胞碎解了。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-6 17:36

回复单个核细胞的帖子0 p; K+ |1 g0 O9 B; C
" y+ ]# f5 ? ]2 v8 ~4 z; {
我的细胞基本上没有长成成纤维样的，但是瓶底用FBS铺了，确实是从贴壁9小时添加培养液时就有细胞爬出来，组织块贴壁不紧，常在第一次添加液体时就已经漂了，3-5天后换液细胞状态还可以，再过1、2天，细胞就碎了。是不是组织块贴壁不紧。

作者: 单个核细胞 时间: 2013-3-6 17:49

本帖最后由单个核细胞于 2013-3-6 18:06 编辑
2 a4 o& Q0 P# B  t- C( Q: U3 d8 q
回复湖南干细胞的帖子

组织贴壁9小时就能爬出细胞？你说的是这个意思吗？你可以描述一下你的培养过程，如组织贴壁时间、加液时间、组织周围爬出细胞时间、换液时间等等。这样大家才能知道你的困惑帮你解决问题。  @3 C" w4 c" ^+ d

另，参考下面的链接：

脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：
http://www.stemcell8.cn/forum.ph ... mp;page=1#pid554020
请教华通氏胶的剥离：
http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html4 c+ S$ v) T# X' ]
应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞：# i9 ]5 x3 l2 h1 v/ \
http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
脐带间充质胶质的备置：- L7 @4 Z+ Q6 B) w0 Q8 Y. {
http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html  h5 J, U9 q" p" V2 i1 y9 \# d3 B
脐带间充质细胞贴壁法出芽率怎么这么低：* c. T, y' t" y
http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
脐带间充质贴壁法到底几天换液：
http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?
http://www.stemcell8.cn/thread-56179-1-1.html+ e; \) g% w1 i  D6 u4 t

作者: 老姜 时间: 2013-3-7 22:44

回复湖南干细胞的帖子

你不妨将组织块用PBS洗涤后，直接加在新的干皿上（实质组织块还是湿润的），量要少于你第一张照片上的量，放入培养箱中3h后，轻轻加入8ml生长液，直接放入培养箱内，4-5天半量换液（这期间不要拿出来看呀，找相呀，太折腾了，它没法贴安身)以后三天半量换液，直到12或15天后，再根据细胞生长状况决定是否吸弃组织块。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-9 11:23

回复单个核细胞的帖子

谢谢。1）脐带在半小时内开始操作，PBS冲洗3次后，剥离动静脉，撕出白色胶块（时间1-2小时）；2）剪碎（0.5-1小时）成0.5-3mm小块，倒入离心管，PBS 1000rmp，5min洗涤1次，添加1ml 培养液，组织块倒入到FBS包被的培养瓶中，9小时后添加培养液至没过组织块，此时已经有细胞爬出，并且很多组织块都漂浮，1天后大量细胞爬出，3天后半量换液，换液后细胞仍在，第5天细胞就基本上消失了，只有完全漂浮组织块及细胞碎片。没有每天动培养瓶，组织块就是贴壁不紧。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-9 11:45

组织块贴壁法培养皿要铺多聚不？用玻璃的还是塑料的？

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-9 11:46

回复老姜的帖子
# P% y1 o) \' p4 i" E$ ?( D+ h. a
谢谢，换液前不敢动了。但是第一次组织块添加液体前就飘了好多。

作者: spring1221 时间: 2013-3-9 15:24

回复湖南干细胞的帖子
$ h5 {* ~+ F) n# u7 V; p f
第一次加液有组织块飘起来是正常的，建议加液时间再延后一点，倒置24小时后加液，贴壁时间太短，加液后就很容易让组织块浮动。组织贴壁法筛选的间充质细胞纯度比较高，也比较容易操作，有些文献报到动静脉跟表皮清除不干净都可以长出来，所以关键还是培养液的选择跟操作熟练度。祝你早日成功

作者: 老姜 时间: 2013-3-10 02:20

回复湖南干细胞的帖子
' B4 ^7 o& g$ k
你用低面积多大的培养瓶养细胞，Ｔ２５总量只能加５ｍｌ液体，Ｔ７５加９ｍｌ还行，平底若铺了血清应该将血清晾干放组织块不漂的可能性才大，液体加多了，浮力大自然漂。培养瓶培养挑出组织块是不易操作的。培养细胞血清的浓度不是愈多愈好，最终不超过２０％为佳，因为体内废物的清除通过血液，血清中的含量也不能忽视。物极必反！

作者: 单个核细胞 时间: 2013-3-11 08:12

回复湖南干细胞的帖子
) S1 t$ q; W& T- t' S/ a
几条建议：
1.华通胶剪碎后不要洗涤，直接接种组织至培养瓶/皿。( U9 c; }/ h2 ^9 b
2.若是采用进口（康宁等）培养瓶/皿，不需要FBS包被。
3.贴壁3~5小时后补加培养液(下午接种的可以第二天加液，即贴壁过夜)，加液后的培养瓶/皿就不要经常动它了。+ a9 Z2 j; @2 I2 V% a% I& ]3 _2 R
4.第二天观察是否污染，8~10天后观察是否有细胞爬出。
5.细胞爬出后，可去掉旧培养液和组织块，换新培养液。
6.待贴壁细胞局部生长致密时，常规方法传代。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-11 08:34

回复单个核细胞的帖子9 L" u4 E. s# L. n3 D% q

谢谢，我确实发现以前没有洗涤的组织块贴壁牢些，我有一次细胞传代了，结果传代后细胞就一蹶不振了了，你也用0.25%的胰酶消化传代吗？我也看很多人用0.05%或0.125%胰酶消化，1:2传代？

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-11 08:39

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谢谢指点。

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-11 08:41

总结了一下各位前辈的回复，我想可能贴壁不牢主要在于，组织块刚接种时，组织块太湿；第一次添加液体时液体时枪头的冲力比较大，细胞容易在添加培养液时被冲下来。所以，打算改进这两点。

作者: 漂泊的风 时间: 2013-3-11 09:06

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不需要的，直接底部贴壁即可，很容易爬出来的细胞，一般5天即可看到细胞

作者: 漂泊的风 时间: 2013-3-11 09:08

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一般不需要的，除非脐血残留比较多，整个组织块是红色的，这时需要用PBS洗涤一次，否则不需要

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-11 09:16

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哦，谢谢。

作者: spring1221 时间: 2013-3-11 09:20

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第一次加液一定要从侧面贴壁慢慢加然后平放，不要直接冲过去。组织块铺的时候的湿度也确实需要注意，加油

作者: 湖南干细胞 时间: 2013-3-11 09:23

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好的，谢谢。

作者: 单个核细胞 时间: 2013-3-11 10:40

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传代用0.25%胰酶即可，T75瓶培养，1:3传代，也可以根据需要接种相应的细胞数，比如2×10^4 cells/cm^2，1×10^5 cells/ml 等等。

作者: 2013sp 时间: 2014-8-28 23:34

回复单个核细胞的帖子; U' \: P3 y1 w6 i

前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
1. 取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。6 b: D, h$ \5 s# ?5 @# t- ~- q
2. 使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。
3. 用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
4. 将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。3 C4 }+ }' x* @- j2 @$ n
5. 纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
6. 整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。$ w' {7 S) U! G4 o
7. 去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
8. 将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）! r, x% |0 m9 z0 d& r' V$ ~+ p
9. 使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。1 a8 w( Q0 J/ }
10. 待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。( t2 t; N8 L4 p* j( j l+ }2 B
11. 4~5天后进行全量换液，以后每三天按相同方法换液一次

作者: 2013sp 时间: 2014-8-28 23:34

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前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。6 B" j- V& b5 {2 h$ P
1. 取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。6 m4 N% B4 h& j+ e# I
2. 使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。 * P4 h8 _; E$ ]0 F6 y1 q$ `, ^
3. 用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
4. 将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
5. 纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。+ f) @, J# O' O$ T1 p
6. 整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。0 q, E/ `' e# h
7. 去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。5 ]; z Z5 t! }! v. g
8. 将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）4 d- w2 @/ y/ `" c' J
9. 使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
10. 待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

作者: 2013sp 时间: 2014-8-28 23:35

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前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
1. 取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
2. 使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。
3. 用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。1 y+ E& N2 X, N# s0 o7 C
4. 将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
5. 纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
6. 整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。$ A3 j6 g5 F |/ d
7. 去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。$ L {% t" I0 l" D
8. 将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）/ h0 m3 f: W0 m; m5 `4 d5 V0 r
9. 使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
10. 待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

作者: 2013sp 时间: 2014-8-28 23:41

回复老姜的帖子6 |# e& ~/ ?. `$ W5 |
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前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
1. 取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
2. 使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。 7 J1 { e5 |4 M& ^5 `! U# V
3. 用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
4. 将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
5. 纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
6. 整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。$ H$ J- G( |- D: T$ {
7. 去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。! b+ Q" E/ J7 Z4 `& t- N0 c
8. 将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）! H% r3 `9 S5 f) }5 z
9. 使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
10. 待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

作者: weijunning 时间: 2014-9-11 11:47

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你这样铺组织太密了，但是应该不会影响细胞爬出，大概在5天左右。下次组织块之间间隔大约0.5cm，留有空隙可以更有利于细胞爬出。

作者: weijunning 时间: 2014-9-11 11:48

回复湖南干细胞的帖子2 I7 J# w8 r- v3 f d7 W
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污染了

作者: yaoting111 时间: 2014-9-19 13:42

接的太密了，让组织块均匀分布

作者: pcljsw2008 时间: 2014-9-22 09:09

提提我的看法，第一，组织块太大了，而且密度太高，应该让组织块均匀分布在里面，互相不粘连，第二，楼主剥胶时间太长了，一般我操作只需要十五分钟，之后就是剪了，第三，组织块剪碎之后不用离心，要是脏的话离心一遍足够了，用生理盐水，不用用dpbs

作者: chslyx 时间: 2014-9-22 11:22

回复老姜的帖子5 L7 ~, S. N6 W9 e7 T3 D

请问一下是不是只去掉了动静脉就可以了？脐带表皮要去掉吗？

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