细胞制备操作SOP

海南小石

! I  `. N: @/ k; |  H$ ~$ w

, k: ]: a9 P/ W7 W( n有一个相关的，希望对你有帮助/ T/ |, [' v) B) y. @- ^
一、目的8 d! t/ X) l) E' o% y. X) B; `

; U; [( E: y9 [, @& JMDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。$ j1 }; _- K" o4 U" v8 T/ K
% E/ s: i" e/ g3 t4 g9 m' v0 w
二、适用范围
5 C2 e! N- M7 X0 M/ m9 H" g1 M! y- N$ B# _1 ~: d
适用于疾控中心所有技术人员 。
5 W/ w& e7 N! H1 Q. P, q5 @" G! l9 P0 i4 E( y
三、程序3 Y# |  `* ?$ f& ~! F
0 r( @7 W/ J) f/ o/ O3 y- V0 d* O
（一）生物安全要求- k# m* ]4 ]# [4 ]
& z6 l! H. ^- z; h; [2 h+ a3 a! I
实验室生物安全级别：BSL-1" Q' N9 e7 q. a$ h' f+ P* U4 u

* T1 y0 d! |/ ?( g- h0 G所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。* j! U& t, g" V4 X6 Q9 E9 m2 V
+ u9 K1 l# B) Q* F2 H9 M2 R
（二）材料
0 R' n2 N/ \  J1 r4 [
' F! x5 P. i2 r& F& ?1. 生长成片的MDCK细胞
1 A( c6 M8 \* {5 ]2 E7 F
+ t) j( a5 d+ }- a4 U  O2. 无菌的T25细胞培养瓶0 j0 g  Y7 t4 O6 _; u7 X' J
' P6 D& s- d: q% V  `# Z% o
3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）
2 R6 w7 N8 N6 B+ V8 @, U
+ Z) n2 v4 ~) t) [4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃
) K1 l. U6 z( R
6 [+ O4 n- B2 {# l* f5. HEPES缓冲液，1M母液" F# U- y) p! N. d6 K

! i0 x4 D' ^4 b% @0 M6. 胎牛血清
( H. }4 [: X- P, X' J/ L# X% g3 R. K. D; |# a: X# b9 x
7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃' E7 U; b5 M, _4 n+ i/ R. B. w* K

/ w# T  N2 O! p( ?5 @8. 7.5%牛血清白蛋白组分V+ q' P3 @3 s2 S5 w5 D& X% h

, g- b+ S4 Z7 i, G* J6 J9. 1mL、10mL无菌移液管: o+ [. Z3 u2 E$ W. W  q
: l& D2 G. d' j) z& K
10. 70％～75％的酒精0 q/ i* I4 V) Y( g# ]

/ X- R4 E9 N* C: q/ R1 b' P) G注意事项：经常检查试剂使用的有效期。1 j. O7 J! N" `
' W0 y+ \. r* Y. g3 `# T; S' [
（三）实验步骤
  v- I$ T  Q: H1 V
& x% `+ A0 K1 Z% B这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
. c6 v: J. ~# h/ }+ \' @$ M# Y; H9 T6 p; @& |
1. D-MEM培养液的准备3 d8 H2 L0 J) b3 K; n6 E

% O: G" g' T* j2 n' b5 ~, ?500mL D-MEM液中加入：5 U0 _' M3 d' C' M* G; M

( D; v; {8 b% Q, T$ p青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），2 h" |6 `" N- p- i! K' j
" j  R4 l9 W3 s8 j. w  e" {$ M
HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。* Q- k1 ~( `9 l) d( a+ @5 l- U2 M

9 s9 k+ B6 Z% F7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL
; \4 M) h- J9 P) c
6 g3 G6 R4 `& E' H$ s2. 细胞生长液的准备7 Y! V7 D  \4 \
6 A1 H& \0 ^4 x7 `
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。' r# }2 V$ a% E3 W

# \# M2 C- C, G" B/ x  c  y- p( e3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
* @! z" B* ^) L7 [
' q+ a! k! H# ~9 T6 i; P' b4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
6 a& N; N$ b5 ^% f7 p# o' I  X" c9 U. O
8 Z8 C0 k& a: A+ W7 ^4 C5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。9 q  U& {0 U) z+ _9 i: S- i

- {; ~$ F7 e: a3 T% I: P6 @* P6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。& V1 Z- y/ w1 n

) d) s# _& j) f( ^# k7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。2 t+ ]5 ]# [3 l( O0 ^: ?) n

4 b  v4 _/ e/ h0 P, r8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）
4 t, R4 m8 K* y9 S# o; V* W$ N, m$ A" M* _+ t' G4 v  u* M
9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。
3 U, l& F6 W8 c( t
2 ^5 y# k# }- [6 \10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
) k' o! P$ |( a$ Z' H