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本帖最后由 细胞海洋 于 2015-12-22 12:26 编辑
$ p* w& U" T i- y/ P
( B1 L+ s% K7 U# r& K4 A1 e有一个相关的，希望对你有帮助
1 o# T' R/ }; `! k/ @& \ }一、目的$ n5 R Q" z' J4 ~: L! s
7 E. S6 m4 Q6 V* b. O
MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。
; r# }6 m+ i0 c
! R4 Z# ^" F9 x F. Y二、适用范围
' f6 ~# P/ ~+ X5 e$ q+ k Q* s ?4 D! {8 d, D3 S: P D
适用于疾控中心所有技术人员 。$ m- e" L& n" ?$ x8 {# b
0 ?2 Z& Y# X1 }' R4 [. i3 W6 H三、程序
: p0 c, v6 u- R. f, ~ J* a6 _) d
（一）生物安全要求1 Y+ p- V. q# [ `3 Q
: @0 \5 p2 P G4 S; X0 C实验室生物安全级别：BSL-1
. T; [$ K$ `% I- `, z. C8 [
, W8 \* C! N: h所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。; Z8 |( ~7 t% ?( d! i! [7 P$ K
0 N6 }9 v( R i1 M- x C0 l$ ~
（二）材料
' q) B" z5 {( @0 l( O0 D2 j: Y$ c: a' f* p' |" g% c
1. 生长成片的MDCK细胞
: l, n* Q- o* q _+ r! ~2 r. s; c( k8 E7 L! L {
2. 无菌的T25细胞培养瓶
3 j3 ^2 g8 z( g+ u: \
8 W! U5 N1 Y$ W! T$ D1 G3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）
2 t: U& Q- ], b5 }/ o2 m
7 b4 w/ Q5 x6 N0 j' x' g4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃
2 d5 M: I0 h4 p. Q* Z& x$ Z
, ?5 G' W( R: d9 Y& H5. HEPES缓冲液，1M母液
3 M+ ~: L! e: I0 `" {5 T+ C: O( Q* K
6. 胎牛血清3 P2 e; i1 m+ h1 @( J
: x/ A4 |+ }3 r V
7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃0 _, n# |# a2 {
) K9 C' X0 C4 ]1 d- r4 s5 c2 O) r8. 7.5%牛血清白蛋白组分V
# m5 | t8 H' ^3 ~% @' H9 Y3 N* i& V% |8 h
9. 1mL、10mL无菌移液管! |2 \! g% t' l( D8 ^
+ `# `0 F: h. x4 Z1 v10. 70％～75％的酒精
, ^- W( x# B7 N0 v+ V- E7 A
( N+ u% F2 H. C注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
% g1 S( m% f& N9 Z* M3 e- ?8 V3 o. Y' f6 q0 `
（三）实验步骤8 V, r5 ?& D5 S1 u- y& B
( |+ _8 r3 L8 O5 o* f+ H
这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。" K0 z% ~ E% C8 ~0 Y; ~! d6 p
) @8 U. r+ Y# [ \1 _% W' m7 l/ g, o1. D-MEM培养液的准备
1 f6 _0 m9 f" H2 s8 M# w' u6 i
+ f- E% h* i, @7 ~' |+ Z* p500mL D-MEM液中加入：0 x) |3 ? x4 i; r
. ~; |5 n/ V' I* e6 L
青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），
q" s( Z" A8 M! g( `3 [( Q
" E7 H5 v, B; Q' r& k* X/ tHEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
+ j6 T9 c2 ~* u* s0 j9 \6 H7 a. j# {: j0 L8 E2 Z; I/ f2 e
7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL $ F6 a) ~& i1 `8 Y, O. R, Z
& I6 s! U; n2 ~$ k: Y
2. 细胞生长液的准备
! [* O3 K8 R) n2 u$ }, {4 B, N. a5 j' c- x! n
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。* N7 e7 t* ]! \ ]! K/ }# H, d
, [ j% s; j! X* ^3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
- C4 y. G; i7 x# l7 N- H8 V' f3 l5 ~2 r* X& d( |( x7 t
4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
, w+ f+ w C* Z- O2 K$ |
8 _0 ]* f0 |6 h* B* v5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
! E9 W6 N: r3 ]$ ^
. Q% V( p" h' c8 T. N* b6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。# h+ |5 ?: {) o' @
' {+ V) @7 o- r2 ?1 k7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
8 l: E& ], t! H( f* I! }4 _, ~. k( e/ u- `4 M& J% m7 o
8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）9 Q/ P$ P. {: n7 p
) T$ y) K1 f& {! @0 H! f9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。) x( C, [6 F+ O! F' ^) \3 G
; \, Z J; v" Z6 k7 g5 j1 B# B+ {; D10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
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发表于 2015-12-17 08:53
