求助流式细胞仪使用步骤及注意事项

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3 Z& x; k6 u( j2 J) S) m: Q# m求助流式细胞仪使用步骤及注意事项     以及结论分析，视频或者详细步骤的文献均可

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小猫狸狸

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一、开机程序3 {. B. |& F4 U, c: @3 A
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　　1、检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟.# {- C! e6 j; x$ a6 d  H- G
　　
' L; D) M4 f. T7 x　　2、打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400ml漂白水原液.打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow）,合上压力阀.确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置.
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8 e6 ]5 r9 }9 N7 D, [　　3、将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5－10分钟.排出过滤器内的气泡.4 Z& S/ j1 l5 Q4 c/ `
　　
$ N2 N$ N3 ^' _) h* w5 a　　4、如果需要打印,打开打印机电源.
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　　5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志.0 }- P( y6 W% j: [8 ^
　　
/ Z& r$ Q0 {& `6 H( z+ R' U　　6、执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡.+ G& o; i4 f/ X& ]  p8 s! D
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　　7、分析样品时,先用FACAFlow或PBS进行HIGHRUN约2分钟.# A+ o: Q# P7 _4 B
　　
' I# P5 Q9 q1 ~' A2 ]+ L& n　　做过分选后,每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗.待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次.
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　　二、预设获取模式文件（AcquisitionTemplateFiles）3 B& x' ?6 |' X
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　　1、从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件.9 V" m$ M7 l5 a- J1 h/ D
　　
+ L9 ~" b* v1 }　　2、选取屏幕左列绘图工具中的Dotplot,绘出一个或多个DotPlots（点图）.从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数." `7 q$ m' E! |% ?: r
　　
* Y; o2 z4 s# R& {  U! ^　　3、选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram（直方图）.
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　　4、将此视窗命名后储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用.* h  @7 U+ |5 {* I5 ^: |
　　
/ P5 }& w/ p" g1 W" Y　　本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP,储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析.+ j" I) P) A( @# D4 X1 R/ H
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　　三、用CELLQuest进行仪器的设定和调整5 l2 [6 _( z5 e/ I; ~, P1 i
　　
% c3 s7 v3 U+ Y4 ?3 [　　1、从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件.
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0 V' P9 [0 X# n* N8 L  e/ \　　2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置., E2 d; k; Q( A$ j- m& N2 o
　　
: W  c( Q+ `( I% g" S2 w7 R　　3、从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件.也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框.. ?7 F: S0 g1 t2 ?$ U, O4 Z
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　　4、在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）：线性模式Lin或对数模式Log.一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMParam选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMParam选择FL2；分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量.* O+ E( n9 P* u. `/ w% N
　　
3 s( `  O  N8 W; y2 v: F8 w　　5、放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上.2 h0 p% x' H/ w; f6 U& H; a
　　
% T! c) M% ?- X# a　　6、在AcquisitonControl对话框中,选取Acquire,开始获取细胞.在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果.未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“?”.3 B& i5 M5 D6 v
　　
0 @7 J, v# n) b( U  j　　7、在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMTvoltages（粗调）与AmpGains（细调）,使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布.
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　　8、在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号（细胞碎片）.一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H.Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量.
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" @  U2 ]$ b7 [( w( r: R　　9、从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域）,并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门.圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易.
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　　10、在Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度.根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内.
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" N" O0 l3 V) w' g( |& z1 i　　11、在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿.比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内,则需调大FL2－？％FL1中的“？”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当. S( @+ |8 @, e2 ^1 X9 y
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　　12、在Status对话框中可见：LaserPower:正常值—Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW；Lasercurrent:正常值为6Amps左右.3 K* m: G0 g+ H# r4 I. s
　　
0 m, ~! C0 R' g2 Z6 M　　13、调整好的仪器设定可在InstrumentSettings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可.
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　　本计算机中已有三个名叫储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderIMM-InstrSettings及FACStationG3BDFilesInstrumentSettingsFilesCalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞.1 z* a9 o+ C, B$ P0 T, y7 W
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　　四、通过预设的获取模式文件进行样品分析/ k  [' B8 r+ ]: U" h  Q& Q
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　　1、从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open,打开预设的获取模式文件.# ^) @! Q; G8 X' _% M' G0 e
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　　2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.
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/ W4 q% \4 T, {7 R/ c' J% |5 b% L　　3、从Cytometer指令栏中选取InstrumentSettings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定,按Set确定.
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　　4、在Acquire指令栏中,选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数,参数,信号道数.其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024.ParameterSaved…则根据不同的检测对象选择不同的参数.
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　　5、在Acquire指令栏中,选择ParameterDescription,以决定文件存储位置（folder）,文件名称（file）,样品代号以及各种参数的标记（panel）,即安排tube1,2,3…的检测参数.一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DNA文件夹中.文件根据日期命名.
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. b% J" V) o8 z9 \　　6、在Cytometer指令栏中,选择Counters,将此对话框移至合适位置,以便于随时观察events计数.
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3 |# k4 }+ P: d　　7、将样品试管放至检测区,在AcquireControl对话框中选取Acquire以启动样品分析测定.
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! G- u8 m8 Z; M3 n　　8、微调仪器设定,待细胞群分布合适后选择AcquireControl对话框中Pause,Abort,去除Setup前的“?”,开始正式获取信号,存储数据.! U8 D  q' u8 e$ }& I
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　　9、当一定数目的细胞被测定后,获取会自动停止,并会自动存储数据.重复步骤7,继续分析下一个样品,直到所有的样品数据分析完毕.
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: P. [3 L8 U/ Q/ {+ K0 P( H　　当所有样品分析分析完毕,即换上三蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态,以保护激光管.
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　　五、关机程序
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　　1、从File中选择Quit,退出软件,选择Don’tSave至苹果屏幕.
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6 D. j- [4 V1 q1 r　　2、用4ml1：10稀释的漂白水作样品,将样品置于旁位（vacuumison）,以外管吸去约2ml,在将样品架置于中位（vacuumisoff）,再HIGHRUN5分钟（内管吸去2ml）.
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3 F$ e$ s; l; O% N8 F# o/ B　　3、改用三蒸水4ml作样品,同上处理.
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　　4、按Prime三次.
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　　5、此时仪器自动转为STANDBY状态,换2ml三蒸水.必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源,以延长激光管寿命,并确保应用软件的正常运行." s$ g1 J& q' O( z: Y# |
　　
1 z0 e! |' z9 m4 O　　6、填写使用登记表.
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