免疫荧光染色步骤 越详细越好

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免疫荧光染色步骤的文章或视频     越详细越好 谢谢

moluxingke

看文章看视频，真不如在自己详细了解相关原理之后，动手做上一遍。然后再把遇到的有关问题请教其他人。

jenny114402

免疫荧光分为胞内核蛋白和表面蛋白/ P3 m( @% ^5 t0 F' M" ^7 O
核内蛋白染色步骤：% u1 i1 [4 K; J0 R" i/ c. l
1.在24孔板内接种细胞，1ml培养基培养，待细胞长到30%-50%染色+ [+ K: A+ q/ _4 Y1 E' z
2.吸弃培养基，PBS洗两次
  e5 n4 B' k2 J* }3.4%的多聚甲醛固定25min
7 s3 y* ^; E3 t" t' Q+ A7 o4.PBS洗3遍& }- g9 }" ~4 u. J: ~
5.250ul 0.25%TritonX-100，室温20min
; D4 L" h$ |/ F- F% N& D2 F6.PBS洗3遍' n2 m3 u1 E5 z" Q, {% {, \
7.200ul 10%的山羊血清，室温封闭30min+ x* ^6 z# k% w; |+ S; l! g( A) @; q
8.弃封闭液，加一抗，避光4度过夜( \. {' G1 Z! H3 Z0 w+ q) o  D
9.PBS洗3遍' m5 X6 w0 r4 m# h# ~3 c! o
10.加二抗，避光室温2h
' B8 u3 w5 t+ K- I6 s11.加稀释好的PI/DAPI，避光室温20min& @3 L# d- E& k7 X, z7 Z' H8 S
12.PBS洗3遍，镜检。

jenny114402

表面蛋白省去TritonX-100打孔

1195963542

回复 moluxingke 的帖子, i" T# T- i& C% a4 X0 R4 ~7 o7 i2 G
6 g3 Y: t. {' T+ q! o4 H1 x
OK  
) E  w, Y" a% h" d3 ^3 _

倒腾细胞

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" ^$ F; s# |! h: b# c% S* {. f4 c  R  ?: }! Z
请教前辈 细胞量有没有讲究  现在在六孔板培养大鼠MSC 过几天想做免疫荧光看细胞fibronectin和iNOS的表达  第一次做没有任何经验！细胞爬片又是有什么用处。

jenny114402

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2 \7 F* b+ x, Y3 v+ E
' i+ A+ H" T- i! F# E8 `我做的是人的MSC，细胞量是5*103， 第二天做的免疫荧光

jenny114402

回复 倒腾细胞 的帖子4 Q6 @+ k0 A& h9 z& m* P1 I3 |" L! d: [
# j- {" E9 q4 J/ z
细胞爬片就是那个玻片是包被过的，有强吸附能力；说白了就是细胞不易洗掉。

jenny114402

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1 B/ L* t" j: O; |
$ _' l& Q+ m+ X( |  s+ J2 f我说的是5*103是24孔板的细胞量，我们一直都用24孔板做免疫荧光，检测mark有点多

倒腾细胞

回复 jenny114402 的帖子( G4 G, h$ w6 W1 I" V& p8 }; v

2 l0 A" N# E3 V我得先用六孔板做transwell间接共培养24h  之后打算接着就用六孔板做IF  不过貌似细胞数量就很多了。。。。。难道要24h再消下来重新计数接种到24孔板吗？