胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

风云动

一、细胞
3 Y: H6 q- k* v8 G* i
8 Q9 Y% {' [- q6 r$ h! A, v 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡8 S* G: Q& K! \# l$ F# ^6 i' I# h

/ f; q0 ?% I4 r1 m$ q 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。% h5 d+ g3 B9 Y
* M8 Q1 }5 j4 f# w- q) E
2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。
" {7 I" s& o5 u- u6 S% h2 |5 J, l2 t7 {  S- n0 f
3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
% Q" f$ Q+ ^( U9 i0 I& L: Y$ v0 t: o
0 q! U) q$ O0 t4 t; Y5 S. O( M 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。
1 s4 r% u7 l; R2 a: F
1 Q% y- e% x4 `$ `4 M, }6 A% O0 { 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。! p# k& @) b6 ?, l% {, I+ |$ e

3 c+ p# ]$ ~1 |, u) K; V 二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
: @; F- k0 n# B6 b/ g
' N3 B4 ~: E/ A+ Z" h( x! F) k& d ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。% N$ Q9 K, X  u, S' D" g

8 _: x8 W# k: F3 c7 q( k2 I3 R 培养基/ d; a/ D8 a. D) b, s
- d# c1 _( `  M" q2 [- f1 M$ I
ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。
( l9 v3 u! t$ x
5 R1 b/ O/ |7 T: | 贮存液& }- s1 d- }1 p* W7 N& a1 M+ V0 c

5 Z. N6 x  T0 T DMEM(高糖)
) m+ ]) F; J6 |. N- q7 A7 s" L. X9 ?% n
马血清（HS）/ |2 A8 @& r1 }' w7 k
: U/ [: m' N7 `% S2 L  e- E
L-谷氨酰胺（200M）9 C; |% E' ]4 ^+ d* d% _" f. {" W

* ^! Y3 ^' ?# I MEMNEAA（10M）
6 E) r4 d8 v% f  ]5 D
' Y* G) ?( Y  h7 \ HEPES（1M）* s- K; J1 V7 ~, p+ R8 E

1 d$ i4 Z. G* {. S3 o ?-巯基乙醇（55M）- i0 `+ L  [/ C+ X" }* F  |

: R, C6 \+ A' _! d0 k9 d( }  A PEST; x( L# }4 j! J0 B$ O4 V

8 {4 E  B& g* U; |7 [' n0 w# N/ }; b' l ESGRO7 R5 ?8 k2 S: e

; W' l- J* E# x( D1 j$ @+ r8 b 复苏细胞
3 V2 w- S6 o+ i0 U, |2 R( R8 U6 n, }+ u+ n
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
1 x- \: m0 [/ j9 M  _& ^5 ~2 U
0 Z  b2 E5 |8 b4 B* S: `8 f& J6 b 步骤0 }; }% h7 i' F, S/ q

: q$ r$ ~' X. [* @8 l 1．从液氮中取出一管细胞；) C& {  b# i& L& r
1 A* o; @( Z! }# m9 l1 l9 y# C( s. b
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；; x' P$ A! D! m- G: |- @8 t; x
7 h- `5 K* V0 [5 C
3．将细胞转移到一15Fn管中；
' `$ o. ~% I! j
  T5 e+ J$ r  Y, W; r' T 4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
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' y1 _+ M+ Q, @% p& {5 ? 5．离心3分钟；
, y, F/ Y0 y3 m# S# v, A4 ?
4 v; s/ F( Y6 {1 X' M 6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；. p# O) D. G& ^, A7 K
$ _3 D7 d  c/ Z; o
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；
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8．孵育。