胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

风云动

一、细胞/ R/ K& B& j. D# ]
# [% ^$ F2 L2 o: k2 b% S: o
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡2 ~. ]3 [8 C2 O: y* F: O
" ^; D: L! s  y
1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。' x3 G$ U% t0 w
6 L; G& d4 W( A4 R0 c# |2 L# ^6 |
2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。" [& v# C* o0 y
0 O$ Z) H( ?, f  P' W8 m
3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。! W" A/ J' l2 q+ z8 a/ s) I0 r
+ K# z; a6 X( l! C+ Y
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。% Y, H6 {5 n1 j% Z! i! ~( R& f
! |! a; ^* I/ A  Z* r
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。, F! s' b0 h; d5 H
4 ]- S2 M0 `0 S0 j! f
二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
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ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。# {# J; l  i: L

4 N; v7 t- U, B 培养基$ K0 N9 q4 G$ M+ F* P6 Y" l% `7 v

, ~) b( I& T: C2 j  z) G* F ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。
: h5 ?, R: k! l, a# Y8 f3 l
( `4 p8 @) R7 V 贮存液
* ~  k& F. A  L+ M& _7 N) t7 _( J$ M0 n5 v
DMEM(高糖)) m4 G$ Y+ t! \* U. C' a$ ], N
1 D6 z6 K/ D# s( W: v6 R% H* |; r
马血清（HS）3 \. G8 N$ o) \+ o4 K7 Z

+ x( H7 d! j  ] L-谷氨酰胺（200M）
+ f) Z" D3 K0 N3 A& B' r0 N) X. R8 d; a# k" H
MEMNEAA（10M）+ |% ], u% t* g) l9 [

( d; N- L4 @& ~) Z* }3 J HEPES（1M）% z8 b! B( y- ?
0 b5 [: g6 o0 F. |; _% N9 J! |: T/ @
?-巯基乙醇（55M）
, u  q* `( j2 U# W. k# x* k' \) w# S4 O
PEST! O3 N) u$ J1 e& ?) p# ~" f

" T" w( j+ D" P& W0 W ESGRO2 F6 }" U! @# Y6 K8 |- C+ e
* z! U+ X& [- r  M8 {) \% K% p
复苏细胞* H& \$ C2 `+ _: V9 z$ ]
- C, X7 U$ M, w' A6 d" J1 [
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
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+ [# `: e  X3 i$ \ 步骤8 z1 h( n" s# ?9 t. j9 {( \2 S* G
4 [$ \: q1 K$ Q$ W
1．从液氮中取出一管细胞；1 G9 L' M( n5 s0 H7 g

7 K* K% A! v1 S0 S, ]9 }- C- c 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；- U% ^& T; M2 x% r5 N2 W

: c# [; s6 P, }) R; H 3．将细胞转移到一15Fn管中；; U; I' x* U+ \) v

; n$ p; ?) `! S% p( I$ x- r: A 4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
# H5 y0 L9 i9 Z) T. x, ]7 q! }
$ F) R: ~( h! y  V0 X 5．离心3分钟；
$ x. w: M* [" ]" k/ K# |/ V% h0 r7 U+ q: S1 h, c( R, B3 F
6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7 ~% u# A1 H2 ]3 n" T5 Q/ e# _- D" H: L
- U: ], D& w, k# M
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；) f! S9 g/ B# g9 c! _
  B2 N9 q: K- I
8．孵育。