胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

风云动

一、细胞. y- G2 K  J- o! z
6 }$ K% M, U5 p: y4 L. L2 g
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡
2 w$ d, w4 X0 L. v8 A# a
: L& C4 s8 X; @2 G7 O- G" |, F 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。
: l) n+ s( T$ Q$ D
9 X' {6 F* K8 ?1 P0 W 2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。0 C& v' V! A2 s% f
, u- F- P, p+ R  ]
3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
5 }  n) _7 ]  Q8 j
& X" V9 l6 Z* H' g6 Z( T0 z 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。
& x: i! S  c2 l4 ^# ]3 b9 Z5 _4 R0 s
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。+ {" O- D9 X6 v3 u" _4 `% T/ C
9 @% r+ k7 n: _9 F4 \$ ?( K
二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
7 u; r6 D/ D& ]! z/ S8 [$ x" d( |! q+ j3 c5 p5 h$ ]# n/ D6 s7 Q( z. R
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
8 l, F" k2 n( i1 X. N6 h' [8 U7 J, g0 g8 Y* I: |
培养基4 r. p3 P# i3 p7 A$ O& x; M3 k

8 D% }! G* Z' x: c6 M( @ ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。
6 k  ^1 e/ l( W3 `% R& h
( m. \5 c: _9 v$ {$ q 贮存液
4 B9 V/ L, u: n& [# R( A' Y7 a8 R+ b8 |0 u
DMEM(高糖)6 o4 M8 g% E& n

' x& c8 h0 H/ K/ X, X 马血清（HS）
4 E/ K  D: k6 x1 U
4 O0 M2 R  o! i( r$ O+ Y7 I+ o L-谷氨酰胺（200M）
3 p; X' t! d: _1 t& l; {2 s% @8 q( K2 R2 Q$ P; o8 w4 d
MEMNEAA（10M）
7 m, ^4 n0 ]7 i( L; n* g$ D/ v& w$ C" P, f& d: A; D& q
HEPES（1M）
  p; I. t6 }- _, [/ w  u% o# x5 l9 x! a
?-巯基乙醇（55M）
4 a' e2 w1 Q1 `2 A7 ~
" l8 U( S# M6 J' m5 H, P! I  } PEST: I6 h& i. N5 [" k$ y

6 Z  A/ S# ]( r% u ESGRO$ F8 D8 Q& Y( j' |* A
( w3 `0 x9 I2 v% c5 |8 V  }
复苏细胞2 x/ s3 \4 G# g0 c% d

1 z: p6 Z7 y+ j( f( ^& m% K 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。  \/ t$ F- ?, Z6 U
, N. C& d* ~: X* Y) ^
步骤: x' ?0 b$ K9 B0 E' L7 i
6 h% _. i# U! y
1．从液氮中取出一管细胞；7 u# O) v: l+ H5 B& s( r
. [6 |; ~1 O. R: E" V% E( p
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
* ~, u# }7 k- N. i$ n6 n0 P  j
+ a+ ?: H. P3 q% { 3．将细胞转移到一15Fn管中；$ D8 F$ x/ {  X9 N9 g  C- t7 v8 f
5 J, [" _$ \( c/ ^9 E( g- J
4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
9 P$ h6 \. K* r$ n+ u/ j
  ?3 |  h; L8 X4 t- l, f' { 5．离心3分钟；
) _# h; u  V: z% u' A
, w9 |+ B! |; R/ N2 K% A; _2 r 6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7 Z/ T1 r% A( Y. ]- p' j5 D

8 |! K( Q* I1 N 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；- F+ c# x4 `5 R: I7 r- \

9 n, C& K+ p$ m9 @+ @ 8．孵育。