胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

风云动

一、细胞
8 z& a$ \7 a: |6 T; h3 S" n  `" W0 j- v( n5 W
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡
( n! [; L3 D: L! u. y& U& h' x' q' s8 ?2 m2 [6 I9 D6 M$ M' w  h
1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。
. {! L8 S9 u- f6 C# E0 y3 Y" X. }+ w( p- Q4 ]
2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。
: V0 @3 H- u8 v% j( D; f2 u9 s# Y! i7 t% a
3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
) H( R1 h& D' \5 S# k+ J' J. P1 C, H5 \. ?2 w0 K
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。8 \  [$ ^  X6 P6 b# Y
7 _  S6 g1 G5 f( d3 }, ]& J$ }
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。
% ^: @3 S  S- Y9 r) P4 U4 O# }9 t5 M( l1 Y: I6 K. L0 ?# [, o
二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
2 s, e4 r7 v5 h7 N1 t1 o+ v! y) T& `+ a6 g0 E# Q( t
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。/ n3 G& `- N$ Y

( m' Z' n- G/ D0 I; @ 培养基
+ W& x8 B" d9 p& ^) h
  z8 u7 k8 X. A( r$ f4 ^( ? ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。
% j% p: ^$ [1 U/ ]2 ^6 E
/ C3 Y- L" [% \ 贮存液# I1 T, Q/ V  O0 R* Z; D# X; t4 q* N1 f

  @6 W/ x+ J' P# w; g! j DMEM(高糖)
& d1 I& {# |4 g: {( H$ v5 O5 v) ]$ N! N3 V. I, N2 A
马血清（HS）
$ o9 x, T9 D. j: g! ~8 T/ G
. }2 N# d# {$ E L-谷氨酰胺（200M）& p0 m& x$ M- r6 J8 b. L: X

5 Q+ Y3 H/ T+ R( @ MEMNEAA（10M）/ n9 s2 }" P  ~! t+ Z3 |
! F2 ^. U8 t7 O8 Z
HEPES（1M）: {$ H2 h) w6 ?. p$ G" Q

9 i3 z$ \2 `! V" I ?-巯基乙醇（55M）
3 ?7 {: F7 P( k) L4 r, A+ p
9 V4 {5 S6 d; ^) r( z1 E2 i$ O PEST- ^+ _& D( l% H) `+ t+ J) B5 i* y

; l5 m6 d  _) v, C( W3 A ESGRO
% \1 H+ T# U: x
; r% J* T6 O1 J) C 复苏细胞
) P0 y0 C8 V  A5 G0 u2 ]( e$ f7 r7 M5 l. L6 C
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。, n* J0 U& N" {

, B5 }9 w$ T' m+ ^ 步骤8 c9 X& A; _8 e  I$ l
- [7 v3 B' I! Q. z/ C
1．从液氮中取出一管细胞；
7 ^. A. q% f, ~/ x* W/ y4 s# u/ z& E4 M" N! V% T- G- t
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
6 y( A" D7 A2 k& L: y+ g% u+ F
6 }) u2 j- n8 R* O 3．将细胞转移到一15Fn管中；- _9 R  D( C9 r/ [$ l" N9 ~  \

7 O: N% G' a8 P# b0 A% C 4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；4 h( H" y- S! X+ N

; C: k' L0 u0 f# T 5．离心3分钟；
+ J! e( F& p4 |* P2 n" w/ `0 q
/ q, W4 V9 y( W, v8 N 6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
9 e+ @5 ^* t  Y$ H3 g8 r: H- `5 B0 M. T5 e
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；
% ^% M' g: W6 _, W/ b, f& M. V; O* d% r) h
8．孵育。