胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

风云动

一、细胞
! c; y! B) W/ h
0 v7 E) ], x  A) q 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡
  R' i; A# l" b& e  y" p  H$ T- T3 ^! a1 C8 j# V$ U0 O1 C' I
1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。
- K0 v' ^) S  }
( @6 L. n6 d3 p9 A3 _; k% ?  L! q 2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。
$ ?5 z+ r6 M9 |& s$ K
5 P3 G! O# s) w& M 3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。# y  i9 o& U/ \+ h( C

' n9 ~5 j, U: H& |/ {! ? 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。3 I& F5 v3 G& f8 Z8 c

2 O; K0 i/ U1 J% C3 c4 K3 n9 R/ F9 z 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。
0 n# T1 o1 j4 B' {
, W+ C6 h  x* v3 V 二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态' w) u0 {: j! {- O; |3 k
% j/ J4 ~1 w: R8 `9 `1 ]) G
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
' o% o7 [% z& c5 F1 k" u9 r: t, ~5 ^3 M% G7 }7 B" o) g
培养基
$ V. n. F: \9 o8 C+ X6 G8 a) P' Y2 e+ F- B9 V
ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。3 E) X1 k; B! I/ o

# M) M0 k9 a7 U& F: x+ G 贮存液8 K9 C5 x' L: H+ }) B* i
- f4 }: o0 l4 A& o) S
DMEM(高糖)
: y1 ]/ g+ P7 w6 @
! g5 z5 j7 l: u: o 马血清（HS）" v- I0 |; S" T

$ K/ N9 l/ Q/ v0 ~- r& X L-谷氨酰胺（200M）
/ v6 C1 _, g1 C
5 k3 k( s# g! i. u- X MEMNEAA（10M）
% _( u  P1 E: c  A% E& I3 b' ]
/ l8 x3 H, O( @  y. h' ` HEPES（1M）9 @* W( z4 ~6 v8 D
7 J/ b0 p  f# }5 T2 `* ?3 a
?-巯基乙醇（55M）! P8 }. h9 |/ ^9 R% v+ v) y0 L) m
5 ~; I5 F  j9 }; N* T8 j7 y
PEST
! J5 i( s) X# W) l: b
& P% _7 ?$ o$ @1 g- I ESGRO
; y: S7 W8 X7 c' R" m9 N$ V7 [* C( u6 {  n; k) Q9 K# j! Z
复苏细胞8 L% q+ _' z8 g% \. c
# a5 @, c7 D6 F2 J
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
! q3 L* X. q  U* n- r5 A2 |+ g2 S! m' X
步骤1 d5 K0 J6 e# M0 ]! h" L
) q, I' e2 a6 n
1．从液氮中取出一管细胞；
/ Y6 T. M" `' y0 ~' i
; i5 G% E5 [* h5 Z# u 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
# J: F* {2 d) K2 ~( N$ G; h9 A6 g. {* U5 O
3．将细胞转移到一15Fn管中；
8 B# N4 O8 V7 b6 e$ n3 O
; b6 j1 t, L. O( a6 t+ @ 4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
* K1 W6 z- S) ]8 d3 _! Z4 @; A) y* `# ~7 b5 e  E
5．离心3分钟；
! l; F; S3 B8 S+ c, ^. Z. b; M' k7 H7 u* v! z* ~& I! m3 V
6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；2 l6 z2 _1 E" c
  t  Y, P+ B1 r0 a( f  @+ }2 G
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；6 Z; l' m- K. f7 W' m3 A

: F2 U2 k. K9 ]1 X+ q1 G 8．孵育。