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一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
4 S: o% h1 d. jES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
- \$ F u; p9 r/ W+ {5 \# `, _
8 k4 D2 `- q" ^, m6 l5 H/ O. W0 x& j0 V; f1 Y
培养基0 s' p `) J @) ~. w2 D0 C
ES:. B' l( M8 q+ f7 D) A
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
( H1 [5 U1 X' ]1 T l& V4 Y/ A% r1 Y" c& ~/ W, ?
贮存液 % Y4 s B- |% x8 z9 J% {8 Z6 |# _
DMEM（高糖）
/ O$ L6 C/ b; l: k% l9 G J马血清（HS） 4 G0 m0 {3 v$ i I$ _1 E; L
L-谷氨酰胺（200mM）
0 z3 m+ t% u' {4 nMEM NEAA（10mM） % X4 t# i7 i3 D6 `
HEPES（1M）
! U, v0 k9 w! U/ N1 ~; W( Sβ-巯基乙醇（55Mm）
4 B+ `- [; w. Y% f# APEST 1 B6 e; n, a$ x5 E- L. v
ESGRO " b8 G1 O- f; H. e( p; Q5 x
* D- A" K( D0 ^0 }复苏细胞. q6 R6 s' F, N- o% Y& S7 Z
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。3 {, p) q2 q: x+ F+ a
% {* p" e1 m$ _
步骤：
" j) b( ]% A: Z* K( G7 C1．从液氮中取出一管细胞；
# q' c+ r, r% d D. x. b b$ s; m2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
" f- ^ h% N" k+ a3 |' d) Y3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；2 Q3 C9 n$ `- ]% c2 ?7 ^
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
# f# u x' B$ ~' d/ p* Z5．离心3分钟；1 Z. Z2 \2 U, R8 A- @' x4 ]! a
6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
, u/ [7 N5 j( N+ f% o2 m7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
V3 F$ r8 `# o4 j+ v8．孵育。
" m& `2 L6 ^: o
! z4 f2 w: W* g% L# o6 |冻存细胞+ e" m- b/ f1 U( ~6 Y/ I
冻存液- R e+ d" E* s# |$ m+ V% R
90％HS和10％二甲基亚砜
: R. ] p$ J( T, ?+ [, \: S+ W: |. C# D5 h
步骤：
+ @8 C7 L* ]6 i, C1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；1 R' X8 e, d4 W0 F. ^. O
2．用细胞刮刀收集细胞；
3 q9 M- C: V) g- j, Q3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；" X" x/ X1 o, j8 o% ]
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
4 T9 f8 t: @/ ]2 z1 j7 q5．分装于冻存管内，每管1ml；7 [# j" |0 D Z* F4 ^
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
' u: v4 R d) f, z! U* A9 ?. P4 |0 E# G; H. L4 u2 _
明胶包被5 _+ p2 r0 C5 d% O6 Q u2 i
准备500ml 0.1％明胶溶液
) x( B# g8 W4 w1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。: Q- G9 t% q8 d7 T' o
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
6 T& u8 k8 _4 i; F% `包被培养板或培养皿- E; S! a# J% t* C5 T N
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
( o+ J4 N9 X- {$ P2 [: e2．置室温30分钟；
' M2 G7 b1 t' N& Z0 b: q& ~3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。 |
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发表于 2016-2-14 14:55
