内皮祖细胞的分离

Diane0321

实验要用到内皮祖细胞，但是我刚进实验室，并没有什么经验，在做之前，想请教一下有经验的大神们，有没有比较完整的分离和培养步骤以及注意事项什么的，非常感谢~~

coffee.cat105

内皮祖啊，你要先搞清楚自己想要的到底是会生长会成血管的那种呢，还是不长的那种，不然很容易坑…………

Diane0321

哦哦，我是要会生成血管的，刚进实验室不久，很多东西都不懂呢，你有什么建议吗？

coffee.cat105

, o9 _% I; U( O, V) l; q0 X
9 H( N1 c0 A+ m# F" s' ^* Q9 ~% A$ _2 J2 Y5 A
这个简单啊，我们做就下面几步
- k$ L- P$ a# ?; G- [& C- b/ U1] Fibronectin铺6孔板，过夜3 a% d( ^, `: y; ]6 f
2] 新鲜血20ml，ficoll分离脐血单个核细胞，200gX5min，洗涤细胞1次，EGM-2培养基重悬。4 t7 s' [: K0 z" F
3] 1X107/cm2密度将细胞接种到铺好Fibronectin的6孔板中，37℃、5%CO2条件下培养。
* n; k4 w+ f$ |, a细胞培养24h后换液，之后3d换液一次。
; V" B+ G, g5 ^- `- C0 k4] 7-10天形成铺路石样克隆，基本每孔都有1-2个，差不多就正常传代就可以了。5 R) {" |. t# r- k; y7 O( K9 `
5]1传3的密度传，大概也就３天长满的样子+ h: P2 J+ A. Q& p: T; A7 \2 _
没了，很容易的4 ]8 Z: S6 d% `8 P  i' q5 ^' ?
不要用瓶，瓶容易坑0 t4 b4 ]9 `% @6 _' g' g
不要用羟乙基淀粉分离单个核，容易不贴壁7 P& K6 R% _7 n% a' c; W& k' {
培养基用lonza的EGM-2就可以，EGM-2mv也行，只要看你下面的实验，在长出来这一步没有区别* U/ b9 v3 _5 u: b4 T2 \/ B! q
4代之内成血管都不会有太大问题，4代以后成的血管就可能会不太好看

Diane0321

嗯嗯   非常感谢您的帮助  

meredith603

单个核细胞种入皿里（每孔4ml培养基）后第一次换液时间推荐是4天后，而且这4天里不要摇动皿不用观察。这样每个六孔板的孔中多则可以达到20多个克隆，少则也有三五个克隆。传代的时候还是计数一下细胞，每孔（六孔板）5*10^4细胞比较容易长起来，但是其实每孔1000个细胞也能长起来，扩增倍数可以达到400-500倍，也可以形成二次克隆。

meredith603

另外，血液千万要用肝素而不是其他抗凝剂抗凝。羟乙基淀粉基本长不出克隆。