内皮祖细胞的分离

Diane0321

实验要用到内皮祖细胞，但是我刚进实验室，并没有什么经验，在做之前，想请教一下有经验的大神们，有没有比较完整的分离和培养步骤以及注意事项什么的，非常感谢~~

coffee.cat105

内皮祖啊，你要先搞清楚自己想要的到底是会生长会成血管的那种呢，还是不长的那种，不然很容易坑…………

Diane0321

哦哦，我是要会生成血管的，刚进实验室不久，很多东西都不懂呢，你有什么建议吗？

coffee.cat105

  t; ]8 F4 h/ M. @
4 P+ `0 }8 ]1 A7 \% d

2 A5 |6 e  K0 k4 @这个简单啊，我们做就下面几步$ F' D; f7 q( |3 g+ q" c' t4 a1 b
1] Fibronectin铺6孔板，过夜
! o* v, k5 Q+ g$ _* Y7 m2] 新鲜血20ml，ficoll分离脐血单个核细胞，200gX5min，洗涤细胞1次，EGM-2培养基重悬。0 x' ?; w$ |1 {0 ~9 x
3] 1X107/cm2密度将细胞接种到铺好Fibronectin的6孔板中，37℃、5%CO2条件下培养。9 H7 \- Z9 [3 B9 Y  Z5 i( R  E
细胞培养24h后换液，之后3d换液一次。
: O+ v' {. n" o2 w# j4] 7-10天形成铺路石样克隆，基本每孔都有1-2个，差不多就正常传代就可以了。
& V, V5 e! V2 `* |$ ^+ l5]1传3的密度传，大概也就３天长满的样子. o; P1 V, W- _$ X& [5 @( G
没了，很容易的
# X6 S3 d  s& M$ H( @4 p! S不要用瓶，瓶容易坑
2 }7 v( E" K0 s& D2 [6 W$ v' T不要用羟乙基淀粉分离单个核，容易不贴壁; [+ Q7 y1 |& i+ A4 ~5 W
培养基用lonza的EGM-2就可以，EGM-2mv也行，只要看你下面的实验，在长出来这一步没有区别: I) W) C) [$ a. H6 P
4代之内成血管都不会有太大问题，4代以后成的血管就可能会不太好看

Diane0321

嗯嗯   非常感谢您的帮助  

meredith603

单个核细胞种入皿里（每孔4ml培养基）后第一次换液时间推荐是4天后，而且这4天里不要摇动皿不用观察。这样每个六孔板的孔中多则可以达到20多个克隆，少则也有三五个克隆。传代的时候还是计数一下细胞，每孔（六孔板）5*10^4细胞比较容易长起来，但是其实每孔1000个细胞也能长起来，扩增倍数可以达到400-500倍，也可以形成二次克隆。

meredith603

另外，血液千万要用肝素而不是其他抗凝剂抗凝。羟乙基淀粉基本长不出克隆。