细胞细化成网状、很难消化成单细胞悬液问题求助？

gxbzjznn

最近在做小鼠的间充质干细胞培养，在做传代培养及下一步生长曲线绘制和MTT实验发现贴壁培养的P3代细胞很难消化成单细胞悬液，基本上一消化就成了网状或者片状？请各路大神帮忙指点是什么原因？用的是0.25的胰蛋白酶！情况分别如下图所示，图1：未加胰酶消化的细胞状态图， 图2：刚加入胰酶的细胞状态图，图3：是消化两分钟的样子，图4：消化两分钟后时间再长一点就变成这样了 图5：细胞离心重悬得到的悬液2 R. r" i+ X& l% F, n5 H

lgfffancy

你这个问题很简单，你没培养细胞多久吧。胰酶消化下来之后，加medium中和胰酶，) Z9 w( |2 a. Y
反复吹打，使其成为单细胞悬液。
0 z. w+ T7 e. d* C* S+ r9 ~# k/ V至于不加胰酶消化，我没有用过，一般消化都需要加胰酶的。

gxbzjznn

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- W# k2 s2 R) N6 |* K# n7 ]$ h# G5 o- u, g- r' M
你好像误解了我的意思 图1是正常培养的贴壁细胞没有加胰酶 也没对它进行消化  还有我养细胞好几年了  这个情况是我一个朋友遇到的 我帮她发帖求助的 （加medium中和胰酶 反复吹打已经做了啊 仍然还是网状 片状）你估计没理解我的意思  要是那么简单的话 我也不会发帖求助了

lgfffancy

回复 gxbzjznn 的帖子, J+ c' w$ y! Q! Z1 p
* C7 k6 x/ E4 K. P1 M. R: D+ d
小鼠msc我也养了很久，也是自己分的。3 M' {8 ?$ B6 ?
如果她遇到这个问题，我觉得可能是她操作手法的问题，& B; A( @& i  v8 e0 R
你可以帮她亲自试试，说不定问题就解决了。

gxbzjznn

回复 lgfffancy 的帖子0 F+ ?* [; g4 S& Q" K3 L
0 x* z9 x$ S: L1 b+ y6 P0 v2 ]/ ~# B
第一次是老师分的 老师也消化了，也出现了这个结果
5 V! S2 M+ q" k% _她以前在其他实验室也做过细胞，从来没有出过这个问题
, C6 c3 `1 X/ B2 W, _2 D, k$ d应该不是手法的问题
3 P6 z8 ~" U: M/ C; b

444352110@qq

可以试一下温和消化液，那样可能会好一点吧

pauldong

这种情况很常见，第一细胞生长时间是否比较长，第二消化前是否冲洗一遍去除原培养液并弃尽，第三胰酶浓度是否合适（我们用过0.125%和0.05%的），第四胰酶是否复温，第五可以试着加入胰酶后盖好放到培养箱里消化两分钟，可能效果更好些。, R/ k* z+ g. u" |7 G1 y
如果这些都不能解决问题，就要鉴定下细胞纯度了，也许掺杂了许多内皮细胞或者别的细胞，一般MSC还是比较好消化的

lgfffancy

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+ {$ T* e4 l! s& u6 d0 ?# D1 {: t' a1 N, H
我很赞同你的意见，如果这样还不行，那可能是MSC已经变了质。

yooung

你试一试我这种方法，即加入胰酶就轻摇培养瓶使胰酶漫过全部细胞，立即轻拍培养瓶，边拍边摇，直到细胞全下来（消化两分钟内）。该方法的关键是胰酶加后立即轻拍，而不是消化两分钟之后再拍。你可以试一试该方法，看其效果怎么样。

gxbzjznn

回复 yooung 的帖子' l: R! j8 \. U- m0 G

: v9 H9 |9 E5 g: s' w" m  O1 m恩 谢谢您 回头我试试