CAR-T的相关检测

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当检测不出来的时候，可能原因有俩：* h, U7 M. m2 r
1、使用的抗体和你设计的CAR胞外结构无法特异性结合或者特异性太低，这个可以通过阴性对照看出来；: |- j  A. k% r1 V
2、你应该在做下WB，确认下你的CAR分子表达是细胞膜表达，还是胞内表达。
+ X+ C  Q, l8 X  n

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3 a9 V; x9 l3 V0 k补充下：如果是膜表达的话，阴性对照如果也测不到就是说明抗体有问题，针对性不强。可考虑采用间标的方式试一试，不然就只能重新设计膜外的ScFV，或者换抗体了。

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/ b3 R5 V9 }1 `' R弱弱的问下：
( n1 l) U& g7 A: `9 |6 }1 F, Q1、分别提取细胞膜蛋白和核蛋白，做WB，不能确定其是否为膜表达？
0 C5 S. ~: T3 P, g9 C' N/ ]% Q2、如果你确定抗体和你的设计都没问题，流式检测为什么不试试细胞打孔标记检测？如果胞内表达，这应该可以测出来。
8 S% |) b+ A3 l! g3 y' z3、我想问下，CAR分子设计的胞外部分，抗体针对的是哪一部分？跨膜区？Linker？现成的抗体都针对的特定区域的特定部分，这里设计真的很重要。

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我看几个大牛做的CART检测抗体很多都是自己实验室制备的，而不是直接买的，这是否也可以说明一点问题？

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8 k; s0 K  b4 [0 q1 G( o& Z+ H7 R
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) _  i( ?/ }1 {" a间标检测的话，特异性必须好，同型对照很重要，关于打孔检测，已经算常规方法了。比如测Treg的FoxP3一般都需要打孔。' W: m7 f) x( |: h
你还可以尝试做做免疫荧光染色，看看细胞表达情况怎么样。表达丰度是否合适，太低的话，可能对流式检测也不利。5 F3 \  |+ T# h% r0 i
这对载体和不同种类启动子等要求都比较高。所以设计的时候都必须检测，选择合适启动子和载体。

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- O/ x  E0 g4 O/ b' A: d- B: ?( g& u- ^- n) E
临床试验还可以标记荧光素？你是准备做个绿巨人出来？

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/ l& j, ^. V2 Y" B* d) a, D; {7 E( V流式针对细胞内蛋白的检测，都是先打孔，然后标记抗体，算比较成熟的方法了。你可以查下，有专门的试剂。