再次求助，MSC的P2代就出现问题，有图

城墨

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2 ?- r5 e/ @# V* ~7 n- e  M抱歉又来版里提问题了，不知道是第几次了，总是会有一群好心人分享自己的知识，让我很感动。" W# ]* p- c, A& D' e4 i! `6 r2 h
这次依旧是关于大鼠MSC的形态学照片，之前的一个帖子在这。http://www.stemcell8.cn/thread-120589-1-1.html$ s% R6 e. a) F. f* c
这次提取的时候出现了一个问题，就是细胞形态让我觉得很差。
& q% B* H  k5 Q& h& s, I有四个编号，分别是1—4，细胞均是P2代。同个编号都是同一皿里细胞，只是拍摄倍数不同。2 q& u( u; T$ F! D9 f
个人认为，除了4状态好点外，3一般，1和2都不行，不知道我的感觉正确不正确。" X, z3 O" B5 X# `5 i0 B2 b5 P9 C! K
也不知道哪里出了问题，上次的细胞呼呼的长，我一传三，两天就长满了，让另一个做干细胞师兄很惊讶。7 z* j& p( H  [/ ~
培养基为低糖的DMEM，加10%的GIBCO血清，加双抗，未加bFGF等因子。这是我用的配方。& X1 t: e0 i/ f" d- \- w
希望再次获得帮助，很感激这里的人。求指点。

yingfeixiang

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+ l4 P5 T8 q4 ?# A. o2 O  N0 U细胞密度太低了吧

城墨

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1和2是一天半的时间，细胞不怎么增殖了。所以我昨天还搜了下这里，发现推荐是3天到80%的时候传代，是这样的吗？

gxbzjznn

有老化迹象！

angelocream

你用的是无血清培养基，然后用胰蛋白酶消化的是吧

edwardellen

你换DMEM/F12培养基试试呢，康宁或者海克隆的都可以，9 H/ W1 l5 o; [# Z
另外你的分离方法是什么样的，大鼠的话，周龄和体重如何？
9 N8 t: R8 m1 U( f" x1 j: O* M细胞状态与分离细胞的样本来源还是蛮相关的，
5 z1 W; \# T, l大鼠骨髓的话，细胞分完之后要把握好换液时间吧，不然好多都是免疫细胞贴上去的，+ y, ]8 Q! C8 q6 o8 q' }! c3 O0 Y
一个是刺激分化，另外也会让间充质不愿意长，
! I2 C, p) x" n" P" l7 E" |/ ~另外你消化用的什么胰酶，浓度如何，过程如何？
! {" ]4 Z9 e7 D& V你洗涤细胞的缓冲液是自己配的还是买的？pH什么的有定过么？
2 x+ `; u1 U. M; ~% `% i" D你传代的时候做细胞计数了么？重新接种的时候有没有换算过密度？% m: q5 }3 m3 R. S) F
总之你最好是先回溯一下自己的实验过程，看看是否有异常的操作，
0 J# r0 w2 F, U; n$ ~另外虽然间充质细胞很好养，但是血清还是很关键的，( d* Z) {! l* L3 d' x4 [) G, n
一定要买好的正品进口血清啊，不然累死也养不好的。5 f5 s  B$ R+ o7 L* p# F+ J' _

城墨

回复 edwardellen 的帖子! b# d' a0 q; M5 g/ @5 E% Z

# c0 E; j7 `$ v: ~你好，谢谢你详细的回复。
: R, c% s* p$ }2 G  x' b7 F我可以逐个回复。
/ z# D7 C$ ~  T4 g6 l) ?# I大鼠培养MSC用的是全骨髓培养法，三周的SD雌鼠，未称量体重。
. ~% `! w9 W( Z; P9 T; F0 A% c换液是，24小时后半换液，48小时后 全换液。但是换出去的液体我没有弃掉，而是收集在新的培养皿中，再经过24小时后，发现同样有细胞贴壁。
& ]9 q6 d& R6 x8 v+ |  Y, s这里不知道您指的免疫细胞是什么意思？怎么样才可以和MSC区分以及分别开来。0 x1 d" M0 i( W
消化细胞用的是0.25%含有EDTA的HYCLONE的胰酶，第一遍洗涤细胞，未用PBS洗涤，然后第二次再过一次细胞，吸去，如果贴的牢的话，再过一遍细胞，吸去放置培养箱2—3min。
; p& q/ T- n" v3 r未做过计数，细胞融合至80-90%进行传代，一传三，细胞密度没有低。
0 i* m; }4 r2 s. C) s3 y5 A血清用的是非常不错的gibco的澳胎，从来没用过国产血清。
8 n% b- E3 p& i& Z) j' Z- ~本次发帖主要是因为操作和之前一次一模一样，而细胞状态差很多。" B2 v, s2 Z% J! D4 q; ^
我怀疑最重要的一点就是我原代培养到第七天的时候进行传代，一个是细胞密度不够，二是消化时间有些长，3分钟左右，导致我后续的细胞老化严重。2 }, e  }5 f" d0 v' m. }2 R
其实我最想问的一点就是，如何分离和鉴别免疫细胞。
/ f% E" R6 s8 \  e/ c- o* K之前我用过PERCOLL的方法，但是效果不佳，遂采用了全骨髓培养。尚未流式鉴定，买那些CD分子只是为了鉴定，好像有些不划算啊。( C" ?7 L: g' I/ x

yingfeixiang

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; A4 F+ M. S# ^* I是的，传代后接种密度也有要求，太高太低都不好

edwardellen

骨髓里是由大量免疫细胞的，至少你可以看见红色的血，如果你做骨髓连免疫细胞都没考虑过，我也是不好说什么了，9 ?" X0 ~" x* W% |) d
我以前做的时候，用的四周的鼠，体重数具体记不清了，你可以在网上查一查，( s9 g% K; d. r7 V
细胞分完铺板，8-12小时就要观察了，如果观察看到已经有贴壁梭形细胞，那就是要全换液的，以后也是每两三天就要全换液，
. u- Q0 y( }- p/ R目的是防止过多的巨噬细胞等贴壁干扰实验，当然如果观察没有细胞贴壁，那就先不换液，保持跟踪观察，毕竟动物之间的差异也挺大，1 n5 ]7 y: v1 I
根据你的描述，我们的方法不同，也许是要做的实验不同，你的做法或许也应该有你的道理，
6 o0 ?4 K6 H! k- S关于消化，不知道你为何用这样的办法，我们是从来不这样做，两遍胰酶更是闻所未闻，# q: a% T* {0 v) f4 u& s1 }" m  V
个人以为，正常的消化流程是弃掉废液，用合适的PBS轻轻洗涤，之后去除，3 f: _* z* ?. e; E2 K
然后加足量胰酶，0.125-0.25%都可以，让胰酶轻轻覆盖全部细胞，室温停留1-2分钟后吸去，之后瓶子放培养箱3-5分钟，) p1 m9 b) |1 V: o
然后用足量的10%完全培养基轻轻吹下瓶中的细胞，离心去掉上清，用新鲜的培养基重悬细胞，之后计数，根据传代培养的容器，按照适宜的密度接种细胞，- [" F* W0 d- Z5 c0 ]8 t9 F0 H: P
关于流式鉴定应该是必须要做的，不知道你分细胞要干什么用，但不论你干什么用，都要先做鉴定，这是最基本的，" Z+ M5 [3 q# n: ]$ D; V* V
如果不是很严格的实验，不用要求太多，但间充质和造血干的几个分子标志必须要有，例如CD11b、29、34、44、45、73、90、105、133，还有HLA-DR，
- Y5 z* @7 r! \, N- T6 c( v6 L9 |什么细胞才是间充质干细胞，不能只看长得像不像，还要有分子标志的表达量符合要求，譬如阳性的应该超过95%，阴性的要低于2%，) I9 ^4 U8 U' F3 s  k: o1 l( q
你所说的不划算的说法，真是让人匪夷所思，如果你都不知道你获得的细胞具体什么情况，你能用它们来干什么呢？
: `: W3 \9 ]& q/ V7 n+ H! ^  Q另外，你纠结的操作问题，或许还要想一想，使用的培养容器是不是适合细胞生长，% y& }7 H: A. u% j! O# U
你的培养基或者血清是不是放的时间太久，长时间使用和多次开启之类的操作是否导致谷氨酰胺失活或者pH改变等等，5 d/ W0 @2 m; _: W5 _5 ~9 W5 b# C  {
说的不客气一点，个人以为，做实验之前，要详细查资料，把东西买齐，设计好方案，之后再开始做，不然既浪费时间浪费经费还折磨自己。

城墨

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) ~& |9 x; C4 J7 X这是我自己经历过的一个最认真、严肃和严谨的回帖了。1 j+ ^/ P# e! W& C! G. B
您几乎把所有的细节和问题都回答给了我，以及这么做的原因。0 i; x6 g- l2 ~8 Y' Z
当然还有批评让我更觉得有必要设计下自己的实验，以及查找更多详细的资料。
# {" B& J- Y( I4 g) K% P: t5 Z. w5 y非常感谢您的回答，我心服口服，而且敬重！