再次求助，MSC的P2代就出现问题，有图

城墨

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抱歉又来版里提问题了，不知道是第几次了，总是会有一群好心人分享自己的知识，让我很感动。
' x5 Q3 o: X3 W' b) H$ @' Z7 k这次依旧是关于大鼠MSC的形态学照片，之前的一个帖子在这。http://www.stemcell8.cn/thread-120589-1-1.html
0 Y$ x9 `& ]4 T9 t这次提取的时候出现了一个问题，就是细胞形态让我觉得很差。
, a6 t4 ^6 q9 `. j有四个编号，分别是1—4，细胞均是P2代。同个编号都是同一皿里细胞，只是拍摄倍数不同。' I" m3 y. p) C$ u8 a, G+ L" F
个人认为，除了4状态好点外，3一般，1和2都不行，不知道我的感觉正确不正确。
" w. P8 ]- d. Q7 D( N也不知道哪里出了问题，上次的细胞呼呼的长，我一传三，两天就长满了，让另一个做干细胞师兄很惊讶。5 ]9 m. S# {5 P6 H
培养基为低糖的DMEM，加10%的GIBCO血清，加双抗，未加bFGF等因子。这是我用的配方。7 S' w- f5 l4 I8 C* i+ h$ \
希望再次获得帮助，很感激这里的人。求指点。

yingfeixiang

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) a- [5 C* @- b1 g细胞密度太低了吧

城墨

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& R/ r8 M- p: m, e7 F3 p6 u1和2是一天半的时间，细胞不怎么增殖了。所以我昨天还搜了下这里，发现推荐是3天到80%的时候传代，是这样的吗？

gxbzjznn

有老化迹象！

angelocream

你用的是无血清培养基，然后用胰蛋白酶消化的是吧

edwardellen

你换DMEM/F12培养基试试呢，康宁或者海克隆的都可以，5 R2 g0 H/ H" a* i2 ~+ W
另外你的分离方法是什么样的，大鼠的话，周龄和体重如何？- e* ?* o$ m/ b/ c( S6 Y* S
细胞状态与分离细胞的样本来源还是蛮相关的，8 z0 B) `7 F* z5 o
大鼠骨髓的话，细胞分完之后要把握好换液时间吧，不然好多都是免疫细胞贴上去的，
2 u5 }# K. j* }8 g9 u) g1 Y一个是刺激分化，另外也会让间充质不愿意长，0 L2 H" G4 }: ^% }# L3 X7 ^* E9 e, W
另外你消化用的什么胰酶，浓度如何，过程如何？
% D# a: F% e* V* t你洗涤细胞的缓冲液是自己配的还是买的？pH什么的有定过么？9 C) W' T* h- g- W
你传代的时候做细胞计数了么？重新接种的时候有没有换算过密度？3 G" q& l7 o4 ^
总之你最好是先回溯一下自己的实验过程，看看是否有异常的操作，1 ^" c. l3 h; B, q% d8 `' e
另外虽然间充质细胞很好养，但是血清还是很关键的，+ ]! a! n4 V1 t! u' g4 E
一定要买好的正品进口血清啊，不然累死也养不好的。
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城墨

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% l2 |! L- [$ l5 \: \
% D) J- f: j) J: s2 O6 i你好，谢谢你详细的回复。
. J% D, N( c  h1 K8 I我可以逐个回复。
* j. ?: h* F# Y  I大鼠培养MSC用的是全骨髓培养法，三周的SD雌鼠，未称量体重。, V% j# R5 K1 ?# w  O
换液是，24小时后半换液，48小时后 全换液。但是换出去的液体我没有弃掉，而是收集在新的培养皿中，再经过24小时后，发现同样有细胞贴壁。; t" r% A/ }1 h- l& T
这里不知道您指的免疫细胞是什么意思？怎么样才可以和MSC区分以及分别开来。
" S& B, O& y( k/ U0 P" f0 r% [消化细胞用的是0.25%含有EDTA的HYCLONE的胰酶，第一遍洗涤细胞，未用PBS洗涤，然后第二次再过一次细胞，吸去，如果贴的牢的话，再过一遍细胞，吸去放置培养箱2—3min。
% d0 X) y5 I$ o3 O1 X, H" a+ N6 F未做过计数，细胞融合至80-90%进行传代，一传三，细胞密度没有低。/ U3 J/ Q: f1 t& B( R
血清用的是非常不错的gibco的澳胎，从来没用过国产血清。
; [  \# I, T8 i$ O4 Y4 U( X! o本次发帖主要是因为操作和之前一次一模一样，而细胞状态差很多。) C1 N5 F6 R" J6 b
我怀疑最重要的一点就是我原代培养到第七天的时候进行传代，一个是细胞密度不够，二是消化时间有些长，3分钟左右，导致我后续的细胞老化严重。
  f0 X1 ^8 {2 f$ P其实我最想问的一点就是，如何分离和鉴别免疫细胞。, s1 x3 K9 j( H2 `, W
之前我用过PERCOLL的方法，但是效果不佳，遂采用了全骨髓培养。尚未流式鉴定，买那些CD分子只是为了鉴定，好像有些不划算啊。
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yingfeixiang

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8 @6 c2 o/ w% j
是的，传代后接种密度也有要求，太高太低都不好

edwardellen

骨髓里是由大量免疫细胞的，至少你可以看见红色的血，如果你做骨髓连免疫细胞都没考虑过，我也是不好说什么了，
6 [2 ^, P/ i, L2 t* t我以前做的时候，用的四周的鼠，体重数具体记不清了，你可以在网上查一查，) t0 \" u7 R% k
细胞分完铺板，8-12小时就要观察了，如果观察看到已经有贴壁梭形细胞，那就是要全换液的，以后也是每两三天就要全换液，0 V2 b! g' g, a" T1 R
目的是防止过多的巨噬细胞等贴壁干扰实验，当然如果观察没有细胞贴壁，那就先不换液，保持跟踪观察，毕竟动物之间的差异也挺大，# P! D0 z; p4 P9 Q. A6 h
根据你的描述，我们的方法不同，也许是要做的实验不同，你的做法或许也应该有你的道理，2 ]& j( {, P9 A; d
关于消化，不知道你为何用这样的办法，我们是从来不这样做，两遍胰酶更是闻所未闻，+ Z7 `! C  g/ S' ^0 q- K
个人以为，正常的消化流程是弃掉废液，用合适的PBS轻轻洗涤，之后去除，, M$ W5 P* }  c9 F+ a6 _( W6 \
然后加足量胰酶，0.125-0.25%都可以，让胰酶轻轻覆盖全部细胞，室温停留1-2分钟后吸去，之后瓶子放培养箱3-5分钟，9 `' J4 D. m; y) p9 O
然后用足量的10%完全培养基轻轻吹下瓶中的细胞，离心去掉上清，用新鲜的培养基重悬细胞，之后计数，根据传代培养的容器，按照适宜的密度接种细胞，9 T6 g3 ]9 o) Z8 h* Y9 A% A! N. }
关于流式鉴定应该是必须要做的，不知道你分细胞要干什么用，但不论你干什么用，都要先做鉴定，这是最基本的，, w9 E! ~; \7 [6 p
如果不是很严格的实验，不用要求太多，但间充质和造血干的几个分子标志必须要有，例如CD11b、29、34、44、45、73、90、105、133，还有HLA-DR，
% H+ _. @6 e0 x- l( N什么细胞才是间充质干细胞，不能只看长得像不像，还要有分子标志的表达量符合要求，譬如阳性的应该超过95%，阴性的要低于2%，
+ k! z6 D0 D3 O) a- K% T; y你所说的不划算的说法，真是让人匪夷所思，如果你都不知道你获得的细胞具体什么情况，你能用它们来干什么呢？
( ^7 g) ]1 ]  C( }! ?  j另外，你纠结的操作问题，或许还要想一想，使用的培养容器是不是适合细胞生长，
: Y; n- v9 W1 L) \0 Y$ R! i你的培养基或者血清是不是放的时间太久，长时间使用和多次开启之类的操作是否导致谷氨酰胺失活或者pH改变等等，
0 b1 ^8 ]( o$ }" }说的不客气一点，个人以为，做实验之前，要详细查资料，把东西买齐，设计好方案，之后再开始做，不然既浪费时间浪费经费还折磨自己。

城墨

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7 B* V6 G5 P, T9 v  N$ @
4 \* m0 w; x$ c) h8 a8 \: M这是我自己经历过的一个最认真、严肃和严谨的回帖了。
. M( j  h4 ]/ U4 [, u您几乎把所有的细节和问题都回答给了我，以及这么做的原因。
$ P0 w) }* |3 a, S当然还有批评让我更觉得有必要设计下自己的实验，以及查找更多详细的资料。
, {5 L* p+ @  w1 a* V- Z8 L" e非常感谢您的回答，我心服口服，而且敬重！