microRNA的qPCR结果问题

wzm123hzy

尊敬的老师们，师兄，师姐们：
% u* h4 C5 F; R. t! Y我做microRNA qPCR时，出现：做了3个内参，其中一个有杂峰，一个无CT值，一个正常。5个unknown里有一个没有CT值，还有一个出现双峰，其余3个正常。求老师们，师兄师姐们，不吝赐教，非常感谢。

zhoujp3651

这样的溶解曲线显然是不对的。引物结合的位点可能不唯一，建议用总DNA先做普通pcr看看条带，或者用cDNA也行。
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zhoujp3651

另外起峰循环数最好在15-25之间，30以上是肯定没有意义的。

wzm123hzy

是引物特异性不好的意思吗，可是MicroRNA全长只有20个bp，引物不好设计，另外做的5个重复里有一个没有CT值，是我操作不稳定?

细胞海洋

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+ d$ w$ G7 i8 G- t' _, ~* y
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wzm123hzy

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# Q# A+ h' u* B+ Z" M0 h) Y7 i  F( M
好的，谢谢老师

wzm123hzy

回复 zhoujp3651 的帖子2 G8 s! h7 m6 i! S  m0 e
' C, K0 x, w* D& h& [3 c
老师，您好，请问是引物特异性不好的意思吗，可是MicroRNA全长只有20个bp，引物不好设计，另外做的5个重复里有一个没有CT值，是我操作不稳定?$ j0 P# i4 V5 @& s% A) D% D

Yedan

5 n' W* Z7 S3 s/ w+ O3 G6 N: K5 z9 l8 r  z0 ?: z* W
回复 wzm123hzy 的帖子. I5 i- J9 c0 q% B  o! R2 v

  Y6 D8 t! T& mmiRNAs的定量检测引物不是针对那20bp左右的序列设计引物的，在你做反转的时候，就会把miRNA成熟序列加长，要么是用针对每个miRNA特异的反转引物，要么用Oligo，检测的时候产物长度会加长到90bp左右（每个公司的kit不同），所以你看你每对引物的溶解峰温度，就知道PCR对不对，再者跑完的PCR产物可以跑个2%胶，如果条带单一位置正确，说明你的PCR没问题。

wzm123hzy

回复 Yedan 的帖子' `- M" f0 g8 v7 a" I7 z( \) p

: j* y5 w: R/ }. Y0 m) _好的，谢谢老师。我再跑个2%的胶试一下。