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冻存方法
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1.细胞:选对数生长期细胞,收集细胞24小时前换液一次。
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, U$ i2 g6 i. H" ~9 i( G2.计数:按常规方法把细胞制成细胞悬液,计数,令细胞密度达5×106/ml,离心去上清,吸入离心管中。
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3.冻存液:先用培养液9分+DMSO 1分(或甘油)配成10%的DMSO冻存液,按上法一滴滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。6 t1 o$ t: S7 |5 N$ e0 d
) G+ j, j) S9 ^# U4.分装:分装入无菌安剖中,每安剖加1.5毫升细胞悬液。
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# J. L& A6 e+ m( \5.封口:用塑料安剖时拧紧瓶口即可;如用火焰封闭安剖口后,仔细检查,定要封严,必要时可浸入蓝色液中观察,为安全起见,把安剖缝入纱布小袋中,以防液氮浸入后,融解时因受热发生爆炸伤人;纱袋一端系以线绳,末端扎有小牌,注明:细胞名称,冻存日期,以便日后查找。' R6 G. v& j0 a7 o0 o: Y
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复苏方法2 W* c. w F f. X
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1.从液氮罐中取出安剖;有时因安剖未封严,浸入了液氮,取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸,因此应带有防护眼睛和手套。9 K$ N% g* }! Q$ U9 |
# ^- U+ |# P, t3 \- z- q& b' t2.迅速放入盛有36℃~37℃水的搪瓷罐中,扣上盖并不时摇动,尽快解冻。/ n: B! C$ v6 I# B$ K
- {! f3 l6 G. Z f" R8 h& I2 Z3.剪开纱布口袋,取出安剖,用70%酒精擦拭消毒后,净化台上打开盖,用吸管吸出细胞悬液,装入离心管中,再补加10ml培养液,吹打使细胞悬浮。
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% J8 Z: k' ?- C" K, A4.低速离心(500~1000转/分)5分钟,取上清后再重复用培养液漂洗、离心。7 q S5 f, q7 N8 D, ]2 L
; C* q9 X8 `- s9 l" M, i: O5.加入培养液适当稀释后,再移装入培养瓶中,置温箱培养,次日更换一次培养液后再继续培养。 |
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