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冻存方法2 s1 `& w' q/ a$ S
! v8 w4 y6 j- D* A1.细胞:选对数生长期细胞,收集细胞24小时前换液一次。! G6 ]7 C" T& v; U8 X" P6 H: I# v
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2.计数:按常规方法把细胞制成细胞悬液,计数,令细胞密度达5×106/ml,离心去上清,吸入离心管中。2 f4 L: h' @7 a! u% T# ]! V& z
) a# H5 O6 ]! J' d- ~3.冻存液:先用培养液9分+DMSO 1分(或甘油)配成10%的DMSO冻存液,按上法一滴滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。
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4.分装:分装入无菌安剖中,每安剖加1.5毫升细胞悬液。. @- v6 q( p! ?$ T4 N/ D- |$ }
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5.封口:用塑料安剖时拧紧瓶口即可;如用火焰封闭安剖口后,仔细检查,定要封严,必要时可浸入蓝色液中观察,为安全起见,把安剖缝入纱布小袋中,以防液氮浸入后,融解时因受热发生爆炸伤人;纱袋一端系以线绳,末端扎有小牌,注明:细胞名称,冻存日期,以便日后查找。4 a& o& X8 X% N
' f2 c* V- x5 }3 @/ u7 k/ A 复苏方法3 x( d% K o/ q
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1.从液氮罐中取出安剖;有时因安剖未封严,浸入了液氮,取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸,因此应带有防护眼睛和手套。$ q+ R( n5 P- I- \
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2.迅速放入盛有36℃~37℃水的搪瓷罐中,扣上盖并不时摇动,尽快解冻。
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" R. H! A1 u/ }$ C( S7 h3.剪开纱布口袋,取出安剖,用70%酒精擦拭消毒后,净化台上打开盖,用吸管吸出细胞悬液,装入离心管中,再补加10ml培养液,吹打使细胞悬浮。
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5 P9 R& N/ S; g) Q3 T4.低速离心(500~1000转/分)5分钟,取上清后再重复用培养液漂洗、离心。/ V7 Z. a& y1 x9 z/ i8 h) Z
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5.加入培养液适当稀释后,再移装入培养瓶中,置温箱培养,次日更换一次培养液后再继续培养。 |
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