实验室常用的细胞冻存和复苏方法

sea663

冻存方法, [) u6 Y, _* t0 h
, C+ q/ }# {1 H. I3 a. @1 g
1．细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。; @: P0 C' m/ u/ z2 D8 t. |( t
' p  U: X, H3 Z- c/ S/ H# ]
2．计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数，令细胞密度达5×106/ml，离心去上清，吸入离心管中。
3 K  }6 o/ G( b$ ~! p: c6 P
0 L% V/ Q7 n; m; e3．冻存液：先用培养液9分＋DMSO 1分（或甘油）配成10％的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。
6 r. B9 @2 `2 ^7 Z4 }  C2 A! w1 P( z" t  q  g7 T
4．分装：分装入无菌安剖中，每安剖加1.5毫升细胞悬液。
4 R' [& t1 I3 F# }+ Y1 C. R8 U; k! {2 |- f; F! }
5．封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安剖口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安剖缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找。
, u. D! ^' K2 O% [  M* ?" B  _0 i3 X
复苏方法; ]2 S4 K! ]) h- V, C" t! D
+ b% c: ?3 r6 _4 ~( R
1．从液氮罐中取出安剖；有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。9 m6 t7 A- s/ z& O( r9 }+ [9 Y; P
5 |& U* e0 M0 ^
2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。1 Y7 R% @  @  N  F) ?" K' i( R2 u
, U# M8 @+ i( I$ W: j! N4 W
3．剪开纱布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮。
' W/ w; X. t- M% x' \* O
1 Y1 ]( [% T6 g+ z$ s4．低速离心（500～1000转/分）5分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心。
6 w( }1 B. A) e, K* I1 c5 F/ o" i8 d& J7 b3 p
5．加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。

sajia

顶一下

mmssyyee

每安剖加1.5毫升细胞悬液,再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮.
0 _! A: y: ?7 {' }2 m请问需要加这么多的培养液离心吗？
: j; [. T! a. M6 g
  D" T6 [$ Y, E: Z8 w& Y谢谢

zpzp0312

3# mmssyyee
8 y0 i: A0 b& |. }; Y/ T2 r: m, p) Y) ?8 U
帖子中的方法针对大批量细胞冻存, b; `* ]0 F  Q9 j2 O- E# k2 n$ f
如果是小批量的，完全可以在冻存管中操作0 D% D& h: T1 H# V
另外冻存密度还可以适当降低，当然也要考虑到细胞种类。

mmssyyee

4# zpzp0312 [谢谢您的解答。

askage

感谢楼主分享

duoduo777001

顶顶

rocfield

回复 mmssyyee 的帖子6 m/ g# X) G+ W

! Z* R/ u  ^7 c; z7 w加10ml培养液是为了稀释DMSO,降低DMSO浓度避免高浓度DMSO存在对细胞膜的损伤使离心时细胞膜破裂。

gondobar

小批量的采用冻存管 先-80℃ 然后液氮

穿裙子的猫

补充一下哈，冻存的时候，我们使用两种冻存方式，1 ?3 d1 K9 t) x4 B$ Q- U
一种是直接使用程序冻存盘，就是把冻存的细胞直接放入冻存盘，放入-80°C，过夜之后就可以放入液氮了，4 T1 t: p4 j/ h8 N( p( s4 j
另外一种是没有程序冻存盘，4°C冰箱半小时，-20°C冰箱2小时，然后放入-80°C过夜后放入液氮保存。
- T  z0 w! n! b/ j% }4 K4 x