基因扩增不出来

微笑流滢

这个基因是高GC还有一些重复序列，该如何扩增呢？我现在只需要扩增这个基因的2000bp就可以了，但是一直扩不出来。也买了公司的适合于扩增高GC的酶，这个酶有自己的PCR程序，98° 10s，68°2min,扩增30Cycles 我试了试，还是啥都没有，我就用常规的PCR程序试了试，还是不行，崩溃。求教

xuyang0317

你看看你的样品是不是有问题，样品质量也是影响PCR结果的一个因素，试试将样品再提纯下。

luomengwu

可以试试touchdownPCR，会耗时久一点，但是如果引物什么的没有问题是可以p出来的，如果touchdown不可以建议换引物模板等，若是touchdown有条带则考虑温度问题

gondobar

看看你的基因是不是极易形成发卡结构，易形成发卡结构的特别难扩增，我遇到过。

微笑流滢

回复 xuyang0317 的帖子3 ^% @5 U5 W; A4 N" W

3 B& N0 l' O& c' {扩增其他基因都没有问题，怀疑应该就是基因本身的问题，如果纯化是怎么纯化呀

微笑流滢

回复 gondobar 的帖子5 r. `; A% k1 T0 O: b
! V* Q: E" f6 P; {5 j7 l' {. ~
那后来是怎么解决的呢？

微笑流滢

回复 luomengwu 的帖子; L5 N1 K0 g; }0 C1 x6 X
' j% J: N. L% c" R/ _9 b
你好，Touchdown只是提高特异性吧？如果本身就没有条带的话，是不是没必要做这个呢？

gondobar

回复 微笑流滢 的帖子
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因为我们做SNP，最后换酶切位点，从新设计引物扩的，折腾一个半月。

luomengwu

回复 微笑流滢 的帖子2 I. q2 ]( t4 Y! t. J( T" V! g# @
! B5 r2 O. q4 X7 R* T% n
是的，本身确定无条带确实没必要做，我之前回复的意思是，你要先确定是本身确实没有条带还是特异性低导致的没有条带（因为您之前只是用的一个条件）。。。

dollar777

1、重新设计引物看看，比如短点, B4 s$ V) K9 t+ j0 e4 w, P; j
2、复性/延伸温度延长点试试6 m# G; D( `9 S* {; R7 |4 }3 S
3、换酶吧