细胞培养时支原体污染的一般情况及如何预防

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细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。
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各国细胞库支原体污染的统计表，如下：
: ]- X( X9 V3 {* Z+ |国家　 受支原体污染(%) 报告年度* J1 v+ u- H: m/ X+ v8 u
USA－FDA 15 1993(past 30 years)
- a4 A( B5 B/ T/ HUSA－ATCC 15-20 1992
; R' ]1 X- i1 c. t2 n' H; w' {2 jJapan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998# ~% X: |5 m4 b
Germany－DSM 36 1990-1994. m4 G0 @! e- w+ i
Argentina 65 1987" B2 K; _9 |. \9 M# N' i
Israel 32 1986-1993/ r* z. R) x6 q
China 95 1990
0 O9 r' S) F! O4 F* s" L
, h$ g9 u6 o* |; H5 q4 a4 c/ ]造成支原体高污染率的原因为：
$ ]  r3 [) g8 u8 [4 A& S4 R  [1.支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） % B. e) I, A- w8 j
2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 % R5 U! _: I" [# K' V4 X0 N: j4 j8 T
3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 # q' q/ X2 @$ l) j# n9 M
4.细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 4 ]# J* s7 [# I- z7 U& f( {$ m
5.研究或操作人员忽略污染问题 8 s* a$ h# C2 v8 {, [7 B  A

8 y0 [) P8 ^/ l9 A& P) }0 X5 L而支原体污染了来源: ! ]3 y( l6 [) e% p* o
1. 已受污染的细胞
0 \% }( c6 i& H) E* f: c2. 操作人员的疏失 " b& p  F8 y& ^: O5 P( I
3. 已受污染的培养基、血清
4 _$ f9 ]- v* L4. 操作环境不良、实验器具不洁等
! {* S  u+ b( p- x1 @2 ?$ \1 d. }4 P0 u. f9 s
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。+ g4 T+ S$ g3 I9 m
去除支原体污染： 1 J# C5 J1 p2 O7 O; }
1. 抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
! y$ [( N. O$ r5 w2. Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine & J$ Y! D9 r3 _
3. Anti-sera
! M; h) O& X/ m4 k预防与控制方面可从以下各点加强注意：8 b5 H7 ^* p2 d: `
G 设备方面： 9 j; u8 N, U! O: j
1. 使用已作支原体测试ok之细胞株
8 T1 a0 }& K$ W4 J) ^2. 于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 . G# f& i& F9 K! G# d' R4 _4 J
3. 使用不添加抗生素的培养基培养细胞
8 x& E; r% |9 I8 s7 D" {" B/ EG 检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
0 K" i9 A& E5 a: {: Q! W9 DG 实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求 - x/ o( B' B9 a  Z7 }

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有关支原体污染之问题与回答：5 Y% T! @6 g  N! Y' X4 [, g- V
o 应如何避免细胞污染？
: u% A( `! z5 ]3 g* v细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
9 D* d% o" }  Q& @; N* zo 如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？
; ?8 Z- Y+ W. b: q& O8 u& x直接灭菌后丢弃之。% A" ^. Z. q* W# K, G
o 支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
1 f1 i6 t& Y4 ?8 P- G; [0 ]不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。4 d3 S$ U7 d7 A. W
o 支原体污染会对细胞培养有何影响？
6 n3 M: y: P9 K8 j1 ]9 R0 x支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。; {& e6 E$ B/ b$ e! T$ o" Y/ ~
o 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？" t: T5 W& `$ S) r$ L$ Y: Q
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 % }: s" X  Q+ m, e5 W* D  e+ w

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支原体之检测：
, x- d, k$ l$ {: |( ?9 _: G# G, B; ?***********直接培养法 *************7 J$ a! P7 ~1 R7 s6 m
· 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。 / r# A! ^7 \$ m5 s( ]# m
· 特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。 - {, `, s/ D0 x  A& Q
· 缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。 7 x: E0 b! o( A4 a3 q) t" B
· 材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
; c2 M# E+ \/ ^· 培养基制备：基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。 ( j) Q# E/ p& T; R) |
· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 ) k1 A2 Q  o% G' f
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
3 d3 H  t/ v/ j. J2 `, P· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。 # F0 ~' d! J$ b. x3 |
步骤：
. {0 ^7 P" Y* L7 e· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
; j/ k0 `  p4 X3 r' E; g· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
  Q( v+ e+ M; u  D0 x· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
" F% \) T( z3 O6 o( Y; I$ w1 g5 W+ S结果判读： % F9 p1 A2 a  I  i
· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。 ; j' Z+ s& \) H9 L3 I2 ^
· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。
* K1 K; _) h) U, u, N: `· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
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DNA萤光染色法
/ U& O  r" `( G: ], T4 G3 @$ M; V8 z3 z· 原理︰利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。
; G7 ?, b8 y; X' e# i· 测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。 / k8 ?$ [0 P: V+ K$ s
· 待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。
- e: c/ }6 Q, X! A0 _· 特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。
4 B% ?$ i7 H+ b$ o- c" d6 J· 缺点：有时仍会有萤光背景，影响判读。   z0 r0 i' U! K& o5 ]% {% e2 f
材料︰ * p6 l  u9 X2 I! K/ a  R5 f$ D
· Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内，使用前过火灭菌﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。
. C+ {4 w7 G& s· Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。αMEM with 10鸖 ( medium for Vero cell) 3 w0 T8 ]7 F3 G+ S
配制试剂:
% E: b( \( x- P5 q. ~) g· 无菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。
: ]! _4 e4 `6 S* S' w/ \6 V· Hoechst 33258 stock solution（100X）︰称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。
# b( F% C1 e5 ]# x3 D· Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。
+ _! Q, d9 r( ]1 c· mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。
& X! v/ ~3 }0 m5 ]% t# x6 l· 固定溶液（fixative）︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。 * Q& S) o7 s3 I" b6 l' m. B& f: Z4 r; \
步骤： " L6 Y4 }4 b$ z' B
· 培养Vero细胞： Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。 ( u2 w" |0 u4 ^8 {
· 在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2x10^4 cells／ml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃, 5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。 : @; m+ l# q+ T6 |; |+ W
· 接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。
: K  ?$ f$ y0 b· 将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的萤光染色观察。 , t! i- F: ?, l% B. G% A
· 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚，负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( αMEM 10鸖)。 2 Y6 E+ c) m1 K: }4 [2 @7 v8 R
DNA萤光染色检测︰
  K! p. C& r9 a9 [! z1 M· 取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。
. e, T9 h* e% L: z; J3 h, I· 于每个well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30 min。 . r' c+ U2 n. j0 M+ H7 f% Q8 s
· 吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。
! c& z5 t. s% Y# A- G2 ?) {' ]· 以100x-400x萤光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束(330～380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。 6 k% a8 k0 ^( K7 b8 i
结果判读︰& a1 I. r, W: U+ D0 P, [7 ?$ z
若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。: `! U! I3 E# U" P
图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。