细胞培养时支原体污染的一般情况及如何预防 - 实验室综合讨论区干细胞之家



免疫细胞治疗专区	欢迎关注干细胞微信公众号

返回列表

查看: 27081\|回复: 3	go [资料分享] 细胞培养时支原体污染的一般情况及如何预防 [复制链接]

youyu

新手上路

Rank: 1

积分: 18
威望: 18
包包: 64

楼主

发表于 2009-6-17 20:38 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。2 e9 O" E3 m! K2 h
, b4 g& ]; U5 F6 N; b- K; C
各国细胞库支原体污染的统计表，如下：
国家　受支原体污染(%) 报告年度
USA－FDA 15 1993(past 30 years)% S+ W4 p  y; o$ }6 K7 {
USA－ATCC 15-20 1992
Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998/ Z3 [) F' c4 i, R1 l4 C8 b( ]- d
Germany－DSM 36 1990-1994: y) F% y- q8 \: B* k
Argentina 65 1987" W: h- x' m! v3 b3 c
Israel 32 1986-1993
China 95 1990
" m* A) m* o! E# w: U% s: i- G
造成支原体高污染率的原因为：
1.支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
4.细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 7 I7 I) a) C) F: P" ~/ r
5.研究或操作人员忽略污染问题 ( p: f( u" p  i- l& F  }6 e& O; V

而支原体污染了来源:
1. 已受污染的细胞 # z, y& X/ b  o! e
2. 操作人员的疏失 + @+ c, z" |( {
3. 已受污染的培养基、血清
4. 操作环境不良、实验器具不洁等 " t/ N, _' P3 V" p4 K, ~1 l

由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
去除支原体污染：
1. 抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
2. Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
3. Anti-sera
预防与控制方面可从以下各点加强注意：
G 设备方面： % b7 R& b2 Z2 \, y' I  h7 `
1. 使用已作支原体测试ok之细胞株
2. 于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 & j+ X* x" N3 c6 @7 W! d& P
3. 使用不添加抗生素的培养基培养细胞 9 Z6 w4 M( Z7 T0 h8 m' ]" m- ~
G 检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。" ~* {5 U- {- Z$ F
G 实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求 4 z" ?  p9 P2 ~2 S+ U
" D# l3 G6 T& \) q5 z1 U( I
8 `% a$ ]5 W, _2 V+ x9 O
有关支原体污染之问题与回答：
o 应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
o 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？' G3 G* O) [- G/ V5 f9 y1 z, b
直接灭菌后丢弃之。, L1 Y/ g# x* [) h
o 支原体 (mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。8 V4 b. v$ i  L6 s( N! |$ [
o 支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
o 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？0 y. o' T! R; h+ S! A8 `5 G
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
2 ~8 q) n! t/ o) E) @  v

支原体之检测：# G; F# ~- T) P8 {0 e* B
***********直接培养法 ************** m# x8 v1 R/ K, X9 @& s# q3 N
· 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
· 特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
· 缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
· 材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
· 培养基制备：基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。 " h; u/ Z* R7 q  N$ R& l- t" o
· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 , y0 K! A7 w; e# t5 k! i
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。 * V8 G0 E+ S4 M( M6 \6 O
· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。 $ Q5 [# n. g4 ?( ?! v* K/ T
步骤：
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。 ( s9 z4 @$ N) z1 C5 p: s& L
结果判读：
· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。
· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。 ; N" P6 Q' {: n  }9 z- \# V4 j
5 P+ ^. x: U3 F5 E& N5 k* X3 P
DNA萤光染色法 # ]/ c, l! C* D, i1 e/ G
· 原理︰利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。 / m" E' a2 U6 L$ H7 H' M
· 测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。 ! o7 ^# N3 K$ k8 a, x
· 待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。
· 特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。 & \9 x8 G% U$ O' B( E
· 缺点：有时仍会有萤光背景，影响判读。 7 l' ?4 O. d5 w4 z& c6 s: P# d' u
材料︰ 9 l. \6 Z/ O% l2 _! x
· Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内，使用前过火灭菌﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。 # F# o/ e$ E+ R
· Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。αMEM with 10鸖 ( medium for Vero cell) 3 u* {3 b' _8 C: e& _& b
配制试剂:
· 无菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。 # x$ C9 X9 k3 I3 x# b9 f& [6 _5 i
· Hoechst 33258 stock solution（100X）︰称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。 # o0 e8 J) ~* ^
· Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。
· mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。
· 固定溶液（fixative）︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。
步骤：
· 培养Vero细胞： Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。
· 在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2x10^4 cells／ml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃, 5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。
· 接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。
· 将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的萤光染色观察。 : ]; u- a7 J3 R* A) @! w5 e+ }
· 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚，负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( αMEM 10鸖)。
DNA萤光染色检测︰
· 取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。 ; z2 Z- }; A- L
· 于每个well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30 min。 / T: v6 [1 \% Y$ v; w" m* r
· 吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。
· 以100x-400x萤光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束(330～380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。
结果判读︰
若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。
图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。