细胞培养时支原体污染的PCR检测 - 实验室综合讨论区干细胞之家



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发表于 2009-6-17 20:40 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体,M.FermentaneATCC19989发酵支原体 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原体 ,M.HominisATCC23114人型支原体 ,M.OraleATCC23714口腔支原体 ,M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体。其共同引物序列来自16s和23s保守区域，外部引物为Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；内部引物为Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。; s( T5 [8 E/ h; i% C3 y

ＰＣＲ反应体系和条件：10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明胶)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的浓度为2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2ｍｉｎ预变性、94℃/30ｓ变性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循环30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反应取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反应以第1次ＰＣＲ扩增产物为模板取1μＬ。

下面有更详细的：$ |  F% r' E: D! I2 x5 H6 l" s0 {
1 ]% P; P: @& \  e9 ~
污染测试--支原体 : PCR方法
原理：4 @0 _% |# Y6 O5 s% K
利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。
特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。) D$ `# i. Q1 a$ S! d8 @9 i
缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。
材料与设备：
ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.! u$ \# [6 c. Q; q- m
提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture
positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)
PCR reagents :5 \# j, Y& K' b/ I# C- n5 K+ \
Taq polymerase ( 5 U / ul )$ ]: z+ `3 V+ R( Y. |% M: J
dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )
10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)
25mM MgCl2
sterile ddH2O
Machine / Equipment：
PCR thermal cycler3 U+ y$ A' m: Y$ o9 |  M; t
agarose电泳设备
DNA电泳胶体观察设备
无菌PCR反应管+ l; P5 i/ @( J
无菌1.5 ml微量离心管
无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans3 y% C" r& d/ [8 {* M  l" M5 R
方法：
此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。  D+ c" k1 q1 w1 @7 o) a
结果：使用UV light观察，并照相记录。 2 v+ h. y# R6 d3 S/ G' @& H  f" N) E

不过应用较多还是巢式PCR

方法：
此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
结果：使用UV light观察，并照相记录。
5 l' r5 u( W" v: k8 e# Q: F' n
3 p* L4 |7 [! e! t- H

方法再详尽点:

3.1 1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：
3.1.1 测试样品 ( 2 ul / each )% `9 n$ V0 W. Z( h' w! G8 B" |
3.1.1.1 直接取样测试细胞之培养液。* J: e! O( X/ t: ~: w0 a
3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
3.1.1.3 Negative control : ddH2O
3.1.2 Reaction mixture ( 23 ul / each )& `) N* _5 U# e
3.1.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul0 x) S% H" W0 b5 g( {3 w% H
3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul
3.1.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l8 c4 t& f! w9 p- f  ]) p
3.1.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
3.1.2.5 Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul, o) @( l  E/ e3 z) s" `
3.1.2.6 ddH2O 18.4 ul
3.1.3 PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler
3.1.3.1 step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
3.1.3.2 step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec* m! Z5 R. B6 k. ], y
3.1.3.3 step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min ) n& x/ x: n8 {8 U" f5 ^& C0 @
3.1.3.4 step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
3.1.3.5 重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles9 r% h3 _9 a8 P9 p: g
3.1.3.6 step 5 : final extension 72 ℃ 5 min
3.2 2 nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）$ H8 L3 j! Z1 Z$ l
3.2.1 测试样品：1st stage PCR product（1 ul / each）。
3.2.2 Reaction mixture ( 24 ul / each )
3.3.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul1 |  @8 U/ k, V4 C' ~9 Q5 W9 P' L' B
3.3.2.2 2 nd stage primer mixture 0.5 ul
3.3.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul
3.3.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul! k( G. B- p3 c. T% @
3.3.2.5 Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul
3.3.2.6 ddH2O 19.4 ul
3.2.3 PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler  p7 R7 ~- j2 H* ], ~
# j( M) H( A7 B
4.0 胶片电泳分析 / r8 _9 e3 a/ N+ P" d- ]; s) T8 \
4.1 胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。7 w, M6 t3 @  s/ h4 L  X
4.2 电泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）: D. A' C, T* m# p5 H
4.3 选择100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )
4.4 取10 ul 2 nd stage PCR产物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。7 |$ [( s0 @- o
4.5 进行电泳分离100V, 25 min。( `! R  Q! q, \3 y) _9 f; s. ]
4.6 胶片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr为致癌物质，请戴手套并小心操作）+ o. l: H+ X6 D
4.7 结果：使用UV light观察，并照相记录。
: z$ L2 o5 o2 R9 E* K
$ Z" q" M: G, A/ U4 p1 O! c
Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit) $ j3 P% G0 Y2 ^( A
$ o, y7 \" K" L