外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：* G4 W4 G2 E! g) w7 j$ g6 ^- ^
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀; N0 v2 X( R& ?! T
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,
. C, m% k9 T/ T3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,: C" X- Y7 d  Q
4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min; ]* a$ L3 k' L% W: q  g; U3 ~0 F: m
5 最后加2ml PBS,计数。
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细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，
$ U$ t8 k7 [! _5 E1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
/ o3 B  Z/ k; w; l4 D' v  \0 p4 F2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

wmch666

分离液多一些，误吸的红细胞肯定会少一些，但仔细一点影响应该不大，主要是可以后期用生理盐水之类的去裂解一下

121qwq

我想问一下，沉淀有红细胞会影响贴壁吗

剡溪兰客

红细胞很正常的，跟血的质量有关系，一般离心刹车最低，血样没问题的话出来都是很好的

fenglinzhu

离心完肯定会有一定量的红细胞存在的。你可以用红细胞裂解液处理一下后再培养。但是不建议用红细胞裂解液。因为红细胞裂解液处理后还是会有少量红细胞存在，而且红细胞裂解液对其他细胞也是有一定伤害的。以前我们做过对比实验，红细胞裂解液裂解过后的细胞状态明显比不用裂解液的差。$ u. T- c' V$ g! `3 m* m% u1 c
建议降低细胞接种密度。红细胞会影响单个核细胞的贴壁，降低接种密度可以减少红细胞的影响。由于红细胞没有核，所以2-3天后就会自动裂解，而且红细胞不贴壁，可以通过后期换液完全去除。

孤独山石

有时候会有一点红细胞，不过不影响后期培养。有些资料说初生有核红细胞可能和PBMC密度相同，分离时会混在一起。建议：1血液不要放太久，如发生溶血这种情况会很容易出现。2 离心降速设0 。3 分离液常温下使用，不要从冰箱拿出来就使用

wzs1985

5 Q& i( Z2 S: O  `8 L/ B! c1 i7 j. a2 T& K6 Y( i* A. e) v
回复 lybai 的帖子5 v- v' u, D" s1 `) C) {* |9 V
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首先，活细胞是在所难免的。只是细胞多少的差别
. v& m2 {% l( _7 Q/ {; ^9 o( ^* a# f其实，如果分离的效果差，你可以试一试用15ml的离心管，这样虽然添加的时间长，但是分离出的效果比50ml离心管的效果好。, m# f  _. t2 w. r/ \0 i4 S# H  y
最后，如果觉得还是比较多的话，可以试一试红细胞裂解液，或者用高渗和低渗液对红细胞进行裂解。但是得把握好裂解时间。+ P+ o; @9 v' u$ D
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lybai

谢谢提供经验！

三月桂花香

一般2000R，30分钟出来结果相对较好，但是有时候吸取的时候没有操作好还是会导致红细胞出现的。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。$ K( J/ X* J# F1 A" P6 [
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2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响6 |7 _% m) `4 e
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