外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：
5 z: u' t* k& ~/ U1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀& `1 g- X1 j# ~6 V
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,0 _5 t9 X* h) O! u3 _: I* r) }
3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
0 h; a2 h" F" L4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min
$ ]( V2 |3 Z5 y5 最后加2ml PBS,计数。
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% F8 g- j7 u% E9 X6 I2 u! \+ m8 z1 d7 h! k
细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，# I0 ?6 ?+ R2 o% S; L) B
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。  x+ q+ i* f, S) B. R: Z
2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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6 ?* r* B. o- P
用的湘仪的
, J) j2 [1 ~* ^/ m( E/ K

niliu730323143

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0 H: u0 g9 z$ H; b
减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

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0 _2 O) L* A4 |6 E) l0 V
我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

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8 ^! I& @5 L; n2 V2 H2 q
离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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7 H2 L4 M2 w! X5 @/ ?6 r2 z0 \+ W, h5 {. L' A2 A
我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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$ ^# @2 D/ ~* r5 }7 p
4 J" S- y6 ~  @: ^谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
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% N! M! v% P( a0 Y2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响
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