外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：" r+ A3 m% F" R: ~8 _+ K
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀5 m" G0 c& Y  U2 v4 q1 z+ k
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,) M) h* @& R3 F7 t
3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,- l  N3 G1 {  U" x9 e; c8 u
4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min; z) l* ^' F8 a& A
5 最后加2ml PBS,计数。
& v9 X! u7 i7 a* F* r4 J 9 h8 z' q8 ?8 i" K3 y

& W9 X; _) `/ B- n细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，
! v/ Z, e) ^5 C9 V1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
% N+ P3 U8 {1 d+ T4 Y! h/ G. S" C2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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7 o0 l( G. ]: t$ _6 x9 k$ y用的湘仪的2 B- k$ l9 X  [1 g8 g5 J

niliu730323143

回复 lybai 的帖子9 \' L) E$ U# C$ N5 W

; ~. k) J/ ^8 t" G) C$ t减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

回复 niliu730323143 的帖子7 p" [$ e( _' I' U# D/ ^4 M1 ]

8 p& X# B) N7 ~. C+ V我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

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0 }+ T0 E( Z9 L$ t% f3 F: K离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

回复 lybai 的帖子* p- y+ ~1 o  }2 \9 E' N

9 p! u$ r; G! \. y我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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1 O3 L$ e' E% p8 J; R: D% R5 C* h7 l9 Q
谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
6 K, y) D8 M7 `) N
0 G3 r4 h2 i/ z) c+ E7 ]2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响
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