外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：
$ x; v% x3 o. J9 u* f3 d8 t1 X  J1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀; ~2 C7 ^+ q: Z( V' E' l5 D
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,
4 f. H6 P9 x+ q0 E, I0 r6 }* _3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
' ]7 H# ~) F/ Q7 E  F4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min* m+ z- p% R# b4 q8 d
5 最后加2ml PBS,计数。
* l3 V2 P# G. X# h: f # m; q! {. x2 a" ^( h( Q, b3 w

& Z1 D( M1 @+ X: [1 @7 C* y3 ?9 t细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，, }& E+ v' U) b$ ~0 @8 i1 o
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
: O6 G) p0 K5 f8 M4 ?2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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; a1 _2 a& {1 K! e8 C4 m7 b% P; `( X6 c& ^% A
用的湘仪的
- u$ k1 x+ W2 a/ Z5 V

niliu730323143

回复 lybai 的帖子" E4 j4 h0 @$ A+ G" R
% ]4 M- @! K! h' N2 @* M4 Q
减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

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  r6 |8 o$ L2 ~$ \9 m) u1 a5 [
" }  k# _& v- E  q我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

回复 niliu730323143 的帖子0 A* Y/ ^9 E1 s* ]; Y5 j% u

8 q$ x8 g7 R$ b离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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5 O. i/ M1 @. U: m. H0 F5 i1 p% K: h" W- l/ p
我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

回复 niliu730323143 的帖子/ b& b, G1 o3 W

! B8 t' D. H. B2 B! g谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。/ k' \2 K7 p. ?  Z5 G, W/ f0 \

4 P8 J9 P6 [4 K5 L' D8 h2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响3 E( u2 M- R& \( c+ K- A

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