外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：3 [9 y/ J0 t; `1 n* \
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀2 I8 ?+ {# p/ L' H0 @( y
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,
# V8 m- u9 Y* l& ^/ Z3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
' ?8 ?6 s* `5 j3 N" V+ v4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min6 M& H1 j* v" {2 a# J8 ?
5 最后加2ml PBS,计数。
( J# _5 I* u- e) [% s( \
7 Q% q2 c" L/ d* ^6 n3 W  g& O9 z4 S$ O! N$ C
细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，; P8 }: D5 k+ ?! h0 C) m
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
2 L  u2 K( V3 b7 Q5 {1 x! i) ]! U2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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用的湘仪的4 y% m# |" L" m: t- v5 y

niliu730323143

回复 lybai 的帖子9 G) M2 _  E' K! {( }

% u* N( H, }8 I  _! ^' D4 P# K+ f  L减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

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- F8 Q1 x' I$ j; Z4 W& ?* H9 G2 I7 \; b/ p
我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

回复 niliu730323143 的帖子% U) p0 a/ D+ r9 r& K" r: |* H

4 ~! _) U: E5 p0 N% {  A) u离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

回复 lybai 的帖子. L  O4 ?" {0 f: M3 u2 e: `

" q, k; I% b  d' y9 Q/ a我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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* O* P+ `& {' S1 D6 p! E- B5 N& L* N7 V
谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
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2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响
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