外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：3 E" l! a7 v  S+ x
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀* P3 R. C( b0 B; s" \6 Q. I
2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,, [' `4 Z5 q+ R& q& I! V" T, n+ k
3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
% e- ?3 ~  P" o( O1 b; c! t4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min
2 p" i" j: S  y( Z7 R2 `5 最后加2ml PBS,计数。
- {* r- }, a  ` " ], w- q4 t9 J1 o( v  w

( y" Z: s5 o' S- a; Q3 q* z! X: o细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，
& M- W% [! o8 j9 f$ z0 O1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。) \  v' v0 L# _; o/ d* X# s2 V% e
2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

回复 niliu730323143 的帖子! D& F9 ]* G! l* E1 F" }- ~
4 |$ v. S. U/ m5 r) e, l# y% X9 Y
用的湘仪的0 v6 d$ H) t* Y  w* S# p* H

niliu730323143

回复 lybai 的帖子2 S8 x$ G0 h- w. k' T

7 ~+ \! G! Y. H, X; Z7 k减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

回复 niliu730323143 的帖子  |* ~$ e0 L8 ?

* f. m0 D$ B" d8 ~我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

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9 x& D( |/ V' o, ~. c) q9 u' U5 U% ^5 E9 X- A8 U3 t( I
离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

回复 lybai 的帖子# P1 Z5 d8 P; Z1 V3 t/ z$ C* I, v
3 E# J, f  E! V
我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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3 |$ v9 G" k2 i, ?& t" r! [8 g* s8 U# S0 q0 g/ F+ A% y+ S0 R  L
谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。5 C  K9 g/ w1 J  a7 `

  g$ ]1 S6 {9 h! c( p" C2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响2 w7 x* o" O9 A% U7 _! ?$ y  T
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