外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：0 Z; t) g3 u, u% i
1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀
* D/ Q  @2 S/ \. Q$ F7 s2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,% N: D, k( ~3 A  }6 C
3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
# h" t4 k' Q( u$ M  M/ Z4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min  \# x! D; Q0 x2 ~" ]9 X3 n0 s
5 最后加2ml PBS,计数。3 T5 B3 |* M% w

. S! w9 w3 w0 k+ x9 `# H
; D, ?# E  o3 H! M3 t细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，
: s( u4 z( k1 x1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
  }' |( l* }' i; W2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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# }  q- c- h  ~
用的湘仪的; z* H7 B) t4 ^# i

niliu730323143

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* U+ u3 |, X2 f# L# g, |2 [
减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

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' R: V3 Y0 {7 w) J: C9 N) M) `/ z3 X8 U
我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

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" B4 M! w1 P2 y- k& [; e: F# G' b2 Y
离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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$ b0 ~  P" V& z3 W
( c9 l0 {0 m! N7 a1 L我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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) p3 \+ p+ e0 \) Y6 ?
谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
) M/ e; J! \, U' n+ K& J' r& y) c, ^+ M+ l" ^1 a
2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响
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