外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：
% f, ^  T- I5 ?6 e0 D, F1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀
5 q1 l( d: b, x& W5 J0 S  Z2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,! ?5 m& F* C& I' o$ c; E# [: `
3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,5 Z+ a8 ?' X$ e" Q
4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min) }  |( c! A1 m$ ^$ G" U3 C
5 最后加2ml PBS,计数。$ d, Q: V, R7 ?7 J7 N

: ~0 U, O* ^" e
# Q% n' o% S* `' O# F1 H) Y) ~细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，2 L5 z# w  P! J9 v; Y  S# C
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
" q% Y5 A/ x  Z9 n2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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( h" E" L9 B  b
用的湘仪的5 J$ ~1 d/ @8 u

niliu730323143

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# {& I3 p' N1 L# O  y# S( R6 K. i+ F
减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

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4 u+ O, D. F3 |; \" q3 P) V1 l1 {8 Z5 q/ [1 e
我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

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" a$ \% d" r( b, |
离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

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, h) N+ I4 z. _; c
我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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8 ^" T& x# @9 b/ d1 W! V- o; @
谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。' x1 z( \  ]7 A
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2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响: x0 J: [9 ~) O! Y. F& B1 W
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