外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：
/ N$ l6 j5 f" j- t( f" i, y8 k1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀
& ?2 L6 U7 O4 ^$ H: h( w2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,
& v; w# D% v, x4 w0 y3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,
/ o% w2 n: u5 f- ]0 o- O" k" p4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min
7 W/ J- r' E6 H8 T5 最后加2ml PBS,计数。, q+ h' A& I" U6 x

+ {6 G7 M. X( y8 e6 D
: G3 w2 S% w( s# B' S$ B; e% u细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，  I1 U2 \9 N3 K6 Q, n2 R' a
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。8 @* m% \! W* v1 x' w+ m/ @
2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

回复 niliu730323143 的帖子
* H6 t& M4 h3 L7 m  i& `0 @  V: l2 D/ K7 z# K
用的湘仪的
* e8 A/ r' M3 B

niliu730323143

回复 lybai 的帖子) {5 s3 `( I$ {: x
$ Q. g( d( b$ ]$ [
减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

回复 niliu730323143 的帖子* |7 C! D" ?$ l" n6 y4 S6 n

: ?  k2 q* E6 K我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

回复 niliu730323143 的帖子
" V  `' j( c  A0 I0 w
0 ]1 F; ?) M& s离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

回复 lybai 的帖子
4 `" `, _' w1 @4 s! c% Q$ c- y7 M( r4 T8 F. z
我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

回复 niliu730323143 的帖子
9 l& A; p; d9 `1 i2 S/ U1 f
! h- c  G# S, ?3 l& M2 W, H/ v谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
* _# S# s" t, r+ N& \) P; L& j/ {$ j2 w+ S1 T
2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响
$ C0 ]" l* D7 K7 E) T# c7 L' P" u2 T4 G$ i6 w