外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：
  i8 f- f( |4 }5 v9 j$ I1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀
5 N  q# X; s  ]' d2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,
) e+ r  x, G3 ?0 P% B; L, {3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,5 M( U' m; ]$ l5 f+ H$ M
4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min* V# n) F; |" ~( y+ @- U
5 最后加2ml PBS,计数。
; [. Z2 I9 J, s7 l- f) L; r  W 6 p/ k6 j, G2 ?/ w5 f+ {3 H
0 f5 J+ b- Q% P- j/ x0 q
细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，; e, G& ]* z: E! x/ b
1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。
; a" L( i! X) p2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

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2 c4 `; o1 V6 k( K) m6 U: A; l, j+ Z) ^) O; @
用的湘仪的
7 R2 k- p  V* R' p/ _" w8 p$ B$ I

niliu730323143

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3 R% B* M$ l7 a# Q! i
& ]$ {9 N* I4 v' n' J# q) q* ]. C, \减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

回复 niliu730323143 的帖子% G; e. Z2 Y! ?6 C
' {* h$ k6 w; Q( E8 R3 v5 I
我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

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7 H7 {/ a& B0 @) b" y离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

回复 lybai 的帖子0 M0 Q# G0 B$ c" M- E! C
: ?0 w% ]# W. a* K
我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

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( j& I: \  C1 C3 r: Y0 l, [. J; Y
! Z4 O# T4 p9 t* t  p2 Y. e谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。  H. D+ O* |* }. ]+ k* D
: n7 v2 f! [1 M8 ^/ i2 E
2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响
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