外周血单个核细胞分离完有红细胞

lybai

我们的主要操作步骤：
: ~# W; p. O5 @; q+ G# f1 10ml全血用10ml 1640培养基稀释，轻轻混匀
7 r, J" H! d9 H& e2 稀释的血液20ml缓慢加到20ml淋巴细胞分离液（Gibico）上。1500rpm/min, 30min,
, K; [. _* R+ V. J! q3 吸取白膜层，然后1:1用PBS洗。2000rpm/min, 10min,' R+ }+ X5 c2 D* Q
4 弃上清，再次加20mlPBS，吹散细胞，2000rpm/min, 10min
1 ~; A$ ?2 R) R' S) C5 最后加2ml PBS,计数。
2 P; A# B0 L& P, o4 U # b0 n# Z0 [( J: m# m

' d) K5 y5 L+ z% m3 d) [6 }( t细胞悬液离完心即可看到底部有明显的红色沉积，显微镜下也能看到红细胞，求教各位大神，
; B; @) L! U) h1 我们第一次离心的时候，转速是不是有点低，我查了一下，我们的转速相当于400g离心力，其它有的人用800g,或2000rpm，我们也试过500g离心，离心完之后，细胞很难吹散。6 ]$ D2 T" p: Z# h4 o6 f
2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是1:1，看别人用2:1~3:1,这个对试验影响大么？

niliu730323143

用得是什么牌子的离心机？

lybai

回复 niliu730323143 的帖子
$ D6 K& V1 G: n2 e0 n8 l- M" d0 i4 ]: A6 K8 d0 R. c' l& s- p
用的湘仪的
  @1 f0 c% H. `! x+ C

niliu730323143

回复 lybai 的帖子
: n5 S( m, o$ E5 B
$ X! N8 N" a: H. o减速的时候离心机的振荡导致分层混乱了，建议用stemcell特制的分离管，这样就不用换离心机了。

lybai

回复 niliu730323143 的帖子
" ~4 E. F& D4 H0 N' @% a- J
4 ?4 t! x% `0 ]7 l9 r# S我们离心的时候，减速设置的是0

lybai

回复 niliu730323143 的帖子) q0 a5 v) O; i; E" a
: X7 x1 c5 c; P1 V0 Y5 G! ~, J% {
离心完成之后，分层还是很明显的，白膜层很清晰

niliu730323143

回复 lybai 的帖子' d9 E& J1 d& z  n

% T3 |. L: }3 u! N我们也遇到这种情况，所以，信不信由你

lybai

回复 niliu730323143 的帖子
: T) _$ [* x  x
" {) ]# X& c" q* N) H$ V( I谢谢您提供经验，我们到时候也试试

cellprobe

红细胞是在所难免的，可以加红细胞裂解液去除。如果不加红细胞裂解液，红细胞也会慢慢的自动破裂。

Diane0321

1 我也在分离单个核细胞，我的离心速度只有1800rpm，20min，加减速度为0，但是我的血样比较少，一般只有2-3ml，离心后有明显的白膜层，在此离心后也是有部分红细胞，所以我们一般都会按1：4加红细胞裂解液进去，室温作用5min，这样基本就没有红细胞了。
+ S9 k( k# [. Q2 W% N% D4 f4 Z
7 a( n0 t6 r0 n9 C# {: `2 稀释血液和淋巴细胞分离液的比例，我们用的是2:1，也试过1：1，感觉没什么影响. [$ O, h0 x( d! {- L5 z

* o* ?, {! a1 ]4 w" g7 j