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MSCs的分离与纯化 & B! u9 }- a0 G. s" k0 e- x
1968年，Friedenstein等利用自然贴壁法获得的骨髓基质细胞中首先证明了骨髓间充质干细胞的存在。用单纯直接贴壁法获得的骨髓基质细胞主要包含成纤维样间质干细胞、小的非粒性细胞（循环干细胞，RS－1）、小的粒性细胞（RS－2）以及内皮细胞等多种细胞成分[2]。为进一步研究骨髓间充质干细胞的生物学特性和分化特点，人们一直试图利用某种方法获得更为纯净、单一的间充质干细胞[3]。梯度离心是目前应用最多的一种方法，Manas等人分别利用1.073g/ml的Percoll和1.077g/ml的Ficoll对同一来源的骨髓进行分离获得两组细胞，分别培养于含10％FBS的DMEM和LTBMCi培养液内，他们发现：细胞传一代后，流式细胞仪检测发现经Percoll分离的细胞表现为均一的间质干细胞标志物SH－2和SB－10双阳性，造血标志物CD14和CD45阴性，而Ficoll分离的细胞中SH－2和SB－10双阳性的仅占21.2%，相反CD14和CD45双阳性的比例却接近了10％，所以他们认为经Percoll（1.073g/ml）分离的细胞为单一的间质干细胞（MSCs），而经Ficoll（1.077g/ml）分离的细胞为基质细胞和造血细胞等多种细胞的混合体[4]。 6 O6 m7 N/ V% u5 ~2 s
上述三种分离方法中自然贴壁法和Ficoll法获得的是混和细胞，在细胞成分方面两者无区别，但贴壁法获得细胞更多，而且增值速度更快。通过Percoll法，我们可以获得高度特异的成熟的骨髓间充质干细胞（成纤维样），但获得量远没有以上两种方法多，而且其中不含有RS细胞，同时增值速度远较前2种方法慢，已有研究表明MSCs增值能力与RS－1有密切的关系，即RS－1细胞的存在与否对维持MSCs的增值能力有着非常重要的作用，而MSCs分泌的各种细胞因子又调节着RS－1细胞的循环。所以有人认为RS－1细胞实质上就是进入循环的非定向的骨髓间充质干细胞[5]。 . ?8 k0 c/ _2 X( m ?
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MSCs的特征
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2 A; u4 w O. _, O% X/ u+ {$ n骨髓基质细胞目前还没有明确的表型分类，骨髓间充质干细胞目前也还没有高度特异的表面抗原。目前研究表明骨髓间充质干细胞的表面表达了多种特异性抗原，以及多种细胞因子和生长因子的受体。如SH－2、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、Stro－1等，其中的CD71被认为是成熟间充质干细胞的标志[6][7]，而作为造血细胞典型的表面抗原CD45，CD34和CD14则表达阴性。见表－1[6][7][8][9][10]。 : O4 b$ s* Q, A- U ~
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表－1 MSCs的表面抗原以及分泌的细胞因子、生长因子、粘附分子
5 o( z, M; n U0 V: Z; Y和细胞外基质 $ Z6 ]) L2 \" d) n- { T
# P3 M0 w2 c7 {0 v. S( A
标记物类型 标记物
0 ~4 O' O) ], S8 _, Y& H特异性抗原 , a9 P- F3 }' n0 S0 ^; X" {5 R
SH2，SH3，SH4，STRO－1，MAB1740，α－平滑肌肌动蛋白， % N3 T* l; p& z( r7 y) ~
细胞因子和生长因子受体 IL－1R，IL－3R，IL－4R，IL－6R，IL－7R，LIFR，SCFR，G－CSFR，IFNγR，TNFIR，TNFIIR，TGFR，bFGFR，PDGFR，EGFR 1 x* k2 U/ Y+ k4 ^, C% V3 m
细胞因子和生长因子 ILs：1α，6，7，8，11，12，14和15
, v& r7 d, F' cLIF，SCF，GM－CSF，G－CSF，M－CSF 0 C2 }! T* @ o9 B4 ~- j. k
Fit－3配体
# Q; g* s/ G3 G. k" ~$ `, o粘附分子 整合素：αVβ3，αVβ5 " w" Q" i0 Q" D$ z/ l) G0 v
ICAM－1，ICAM－2，VCAM－1，ALCAM－1，LFA－3，L－选择素，endoglin，CD44 # l1 `7 ~- Y% x, Q) K' z$ U" r
细胞外基质 胶原：Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ型 0 t. e( [" `+ h3 Z$ d% B
纤维连接素（fibronectin）
# m% ]0 |; z3 M1 d' l: M2 C层粘连蛋白（laminin），hyaluronan，proteoglycans . g; A- a/ h1 d
* H9 j/ q8 Q8 B0 S( p' b' p从表－1中我们可以看出骨髓间充质干细胞的表面抗原非常复杂，MSCs也能分泌种类众多的细胞因子和生长因子以及粘附分子和细胞外基质，这就提示MSCs在骨髓微环境的构成以及维持骨髓微环境的功能中有着非常重要的作用。而在骨髓的组成中起着重要作用的骨桥蛋白和透明质酸的受体CD44在MSCs表面的高表达也证实了这一点[8][9]。2 V3 e7 m) _' s2 O$ y, W& O ?9 W
1． Marx JC, Allay JA, Persons DA, et al. High-efficiency transduction and long-term gene expression with a murine stem cell retroviral vector encoding the green fluorescent protein in human stromal cells[J]. Hum Ther, 1999; 10(7):1163.
/ Q7 K, z. T) b) m! Q8 U2． Friendenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, et al. Heterotopic transplants of bone marrow, Analysis of precursor cells, for osteogenic and hematotoxic tissues. Transplantation 1968; 6:230-247. $ O) |4 H' }: ?' F% c/ r; d' o
3． 刘晓丹，郭子宽，李秀森等。人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立。军事医学科学院院刊。2000；24(4)：282－284.
! E1 G( x+ Y8 D: q4． Manas KM, Mark AT, Joseph DM, et al. Phenotypic and functional comparison of culture of marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs) and stromal cells. Journal of Cellular Physiology 1998; 176:57-66.
! G5 v; R$ s; V% n& p" z5． Colter DC, Class R, DiGirolamo CM, Prockop DJ. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc Natl Acad Sci USA 97:3213–3218, 2000.
+ B4 h0 u, O6 B% Q- e8 I" [8 n& b6． S.E. Haynesworth, M.A. Baber, A.I. Caplan. Cytokine expression by human marrow-derived mesenchymal progenitor cells in vitro: effects of dexamethasone and IL-1 alpha. J cell Physiol. 1996; 166:585.
& j) r% G1 j2 m7． Paul JS, Beberly TS. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, Stro-1. Blood 1991; 78(1):55-62. 2 w4 ~" g6 a5 J; `' A* j B
8． Conget PA, Minguell JJ. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells. J Cell Physiol 181:67–73, 1999.
# `3 ^, L" f$ W2 t; g9． Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284:143–147, 1999.% B0 P" A* k& R; g
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SD大鼠（由四川大学华西实验动物中心提供）。无菌条件下分离大鼠股骨，去除软组织，切除股骨端。用5ml DMEM(L)培养液冲出骨髓，吹散细胞，2000转/分，离心10分钟，弃上清。用DMEM(L)培养液3ml制成骨髓细胞悬液，贴壁缓慢加入装有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，2000转/分，离心30分钟。小心吸取界面层细胞，用DMEM(L)培养液洗两次，收集细胞，血细胞计数板计数，以4×105/cm2接种于25ml培养瓶。培养条件为：DMEM（L）+10%胎牛血清+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素，37℃，5%CO2孵箱静置培养。第3天首次换液，弃悬浮细胞。第14天将融合生长的细胞以0.25%胰蛋白酶消化传代，接种密度1×104/cm2，每3~4天达融合生长后传代。6 A+ R, L) O1 Y* t8 t; ?
另外，比较了一下关于几种分离液的细胞增殖和分化能力：发现percoll(1.077)所的细胞能较早纯化，分化能力好，但是其增殖能力较差，因此建议采用这种方法获得细胞进行分子生物学的研究；而淋巴细胞分离液（上海第二试剂厂）所得细胞增殖分化能力都较好，但须传至2代以后才能纯化，因此建议使用这种方法进行组织工程的研究；另外，ficoll(amersham)的细胞分化增殖能力皆较差，可以摒弃之。1 _8 i' Y& p0 l! e9 O: m7 g0 T
还有，关于分离后细胞首次换液的影响：大鼠的一般3－4天换液后细胞的生长能力较好；而小鼠的一般1－2天换液较好；人的7天较好。: Z1 o7 h/ o, u" E! V, e* j+ F
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再谈谈个人的一些经验:
' U" E. a) Q7 s1 在用等密度梯度离心法分离MSC时,一般取白膜样界面层细胞(单核细胞层)即可获得MSC, 其实在接近界面层的上层细胞(约1-2mm)仍然可以获得MSC,只不过相对较少而已;而在接近界面层的下层细胞就很难获得MSC了.这样,如果不想多做原代的战友就可以使用这种方法,多取些接近界面层的上层细胞进行培养.$ X- ^: e* \1 |: F1 n: M) F0 q
2关于兔MSC的获取:
# ?- u7 W, _. V' \( K. v将新生日本大耳兔(10d左右)断颈处死，75%乙醇浸泡5min，无菌条件下取四肢长骨，在D-Hanks平衡盐溶液中清除骨表面的软组织及骨膜，去除骨骺，用α－MEM培养液清洗骨干部2次， 然后在α-MEM全培养液（含15%胎牛血清，青霉素100U／ml，链霉素100μg/ml，25mM HEPES，pH7.0～7.2）内，将骨干纵行刨开，轻刮骨髓腔至颜色变白，用尖吸管(5ml空针、25号针头)吸取培养液反复冲洗骨髓腔面，收集冲洗液，用细胞筛网过滤，去掉骨碎片， 1000rpm离心5min，沉淀物加10ml培养液悬浮，血细胞计数器计数，使悬液含细胞数为1×107个／ml接种,孵育80分钟后第一次换液,轻轻冲洗未贴壁细胞;以后每2-3天换液,7天后可以传代,2代以后细胞即可纯化.这样获得兔MSC细胞增殖分化能力都较好,可以传30多代,仍然保持干细胞特性
+ D& @* L; L, Q* p2 y0 r5 z8 O3 关于山羊MSC的获取:采用Percoll离心,2400rpm,30min的效果最佳.
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1 O; h9 h& c; z4 M SC 的二维培养
) V& ~1 T. Z( v. @- J, [; f7 A% T4. 1 低氧张力下的培养
- ^6 U! o# r# b/ v1 _* Y机体外部环境中的氧张力(140mmHg) 多显著高于哺乳动物组织中的氧张力, 如人动脉血氧张力为95～100mmHg, 骨髓中氧张力为27～49mmHg[16] , 相当于氧浓度的4%～7%。尽管机体内存在着谷胱甘肽过氧化物酶, 超氧化物岐化酶, 过氧化氢酶等保护因素, 但当机体内氧浓度异常增高时, 细胞及组织功能不可避免地受到损害, 因此, 可以设想[17] , 在体外进行细胞培养时, 如氧浓度低于20% , 则会更有利于细胞功能的存留。" _& a& N+ `# A& I t3 e( E. C" A
90 年代初期,Deren 等[ 18 ]在体外采用低氧张力培养牛骨膜细胞, 不仅细胞增殖速度得到明显提高,而且细胞碱性磷酸酶的表达也大大增强。后来,Lennon等[ 17 ]在体外培养鼠MSC 时, 将95% 空气、5%CO 2 和5%O 2、5%CO 2、90%N 2 两种培养条件进行对比研究, 发现实验组原代培养中M SC 的贴壁率及存活力提高, 克隆数明显高于对照组。相差显微镜观察发现实验组第一代培养中细胞克隆大, 克隆数量多, 且克隆数多少并未影响细胞增殖速度。另检测发现第一代培养中细胞碱性磷酸酶的表达增强,原代培养中的细胞则更趋向于成骨和成软骨。
- \4 v" s" S& v: c. s: L, @- |4. 2 极低密度传代培养
, _9 z: B3 M7 c8 x6 a* a不同的实验室在进行MSC 培养时细胞传代密度有所不同, 尽管均可获得在外部形态上都成纺锤形的成纤维细胞块, 且都具有多分化潜能, 但是彼此间的扩增速度、扩增倍数以及所得细胞群的异质性均存在较大差异。大多数实验室认为高密度传代培养细胞生长缓慢, 通常的解释是培养过程中细胞与细胞间的接触抑制, 但是否由于培养的细胞在培养过程中分泌的某种物质导致这一结果, 尚在进一步的探索之中[9]。6 h+ s8 V( l3 P5 ?
Bruder 等[19]采用较低密度(5 000/cm2) 传代培养人MSC 时, 发现两周左右细胞集落融合, 细胞数扩增3～5 倍。有研究发现[ 9 ] , 极低密度(0. 5～ 12/cm2) 传代更有利于细胞增殖。在0. 5/cm 2～12/cm 2范围内, 尽管每100 个细胞所形成的克隆数相同, 但克隆的大小却截然不同。经对比发现, 1. 5 或3. 0/cm2 传代培养所形成的克隆大, 10 天左右细胞扩增2000 倍, 对数生长期12 小时即扩增一倍; 而6 或12/cm2 传代培养所形成的克隆小, 其中12/cm2 传代10 天仅扩增60 倍左右, 对数生长期倍增时间为24 个小时。另外, 实验中还发现, 按1. 5.cm 2 密度传代培养可持续传代50 代, 而按5 000/cm2 密度传代培养仅传代15 代。; ? @+ E& o# N% m( X/ t
最近, J avazon 等[20] 又对极低密度下人与鼠MSC 的培养进行对比研究, 结果表明: 后者①对极低密度传代培养更敏感。同等密度(2/cm2) 传代12天, 前者细胞扩增2 000 倍, 而后者细胞扩增达到4 000 倍; ②细胞扩增更迅速; ③培养过程中须频繁更换培养液; ④细胞扩增时形成融合; ⑤成熟的骨髓基质细胞能产生RS 细胞和单细胞源性克隆。认为两者差异的原因可能是: 自鼠取得的骨髓样本中本身已含有较多的祖细胞; 鼠M SC 在培养过程中已发生转化。
( i' P/ r u+ q1 Z; F) v+ e' a4. 3 基因转染的MSC 培养
d% F$ r" f; R# ?' D& k- p5 I对MSC 进行细胞学研究, 发现它是一种相对静止、更新率较低的群体, 外源基因导入后可以持续表达较长时间, 一些学者试图通过对转染了筛选基因的M SC 进行培养, 从而达到纯化该细胞的目的。5 Q3 ]2 K( o1 o4 u6 k1 k
Kitano 等[12] 以逆转录病毒为载体, 携带LacZ和neo 基因靶向体外培养的鼠MSC, 经G418 筛选后的细胞在原代培养中形成了大的成纤维细胞克隆, 检测未发现造血系细胞的污染, 细胞表达低水平的分化标记, 但仍保持原始表型, 保留着向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能。在实验中, Kitano还发现用不同的包装细胞, 所得的实验结果也不一样。分别用72CR IP 和72CRE 培养的上清液处理人MSC后, 前者形成的克隆数为70. 3.1×107, 其中8. 3 个为大克隆(> 700 个细胞) , 后者形成的克隆数仅为3. 1 个.1×107, 且均为小克隆(< 20 个细胞)。另外,基因转染原代培养过程中, 第1、2、5 天分别开始用G418 进行筛选, 结果表明第1、2 天开始筛选所得的细胞形成的克隆大, 第5 天开始筛选所得的细胞分化潜能低下, 且形态多变, 认为细胞的筛选应在基因染的早期进行。
/ m5 r; |& u/ h5 r5 M SC 的三维培养
/ a/ w) n3 V6 S0 j+ M二维培养技术已普遍应用, 尽管逐步得到改善,但仍存在着难以克服的缺点: (1) 贴壁的表面积有限, 细胞产量低; (2) 无菌操作过程繁琐, 容易污染;(3) 代谢产物逐渐积累, 排除不及时易引起细胞生长不良甚至退化; (4) 细胞离开了体内同细胞外基质共同构成的三维立体结构, 生物学行为受到影响, 容易变异。' ^$ b# F% a: ]) U6 m
因此, 有人提出三维培养的设想。1998 年,Q iu[ 21 ]对鼠骨髓基质细胞进行三维培养, 扫描电镜检测发现微载体cytodex23 表面大量细胞覆盖, 并相互桥接在一起, 组成了三维多细胞聚合物。聚合物中可见矿化结节, 免疫组化染色可见碱性磷酸酶和1型胶原。Glowacki[22]用胶原海绵作为载体进行三维灌注培养, 减少了代谢产物的聚集, 结果发现细胞外基质含量提高, 所培养的细胞活性和功能均加强。但cytodex23 和胶原海绵均为实心载体, 比表面积较小, 细胞难以大规模扩增。大载体生物反应器已成功用于某些植物和动物细胞的大规模离体培养, 能否将其用于M SC 的扩增培养, 并形成产业化, 从而满足细胞工程和基因工程对种子细胞量的需求, 还有待于一些问题的顺利解决, 如大孔微载体的研制、细胞与载体的粘附、贴壁细胞的洗脱等。 a# p2 N1 S, i
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发表于 2009-7-13 14:18
