第三天（8月17日）中午观察细胞，并消化传代

泡沫清风

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! V+ v2 B8 |$ X3 D/ j+ _
第三天中午，差不多复苏后50小时左右，观察细胞  j# w- r  n" \7 N

8 n8 u' K' K* j# C/ W

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3 ~+ R& W7 r! v( v& U4 ?不同的实验室消化传代的方法不同，我的方法可供参考：
3 |& n) T8 E, r7 y: y
( ~0 u+ [) ~* q5 o实验前准备：% x, j8 i* y' P" |  l3 _; z" l* V
（1）DMEM+10%FBS# g! A. E; S( [- t& `& m5 Z) g  A
（2）PBS
* t9 Y5 X/ N3 ^* {3 _+ ^# K（3）0.25%胰酶
2 ~4 o* H3 K3 d6 t（注：同样这些试剂要平衡到常温再做实验）! ~3 M8 N4 S% O1 Z( Z3 O

, M0 j. Q3 L1 B5 F实验步骤：
* a" x6 E) V3 A1 q（1）弃去T75瓶中的原液。4 G$ G) L9 Z' p4 b) C+ `6 f0 Q
（2）加入5mlPBS洗一遍，洗去残留的血清。7 x# x7 s( `+ ~
（3）加入3ml胰酶，大概常温放置1-2min。
2 U! ^$ Z: J6 E5 {+ q6 W（4）加入6ml新鲜培养基中和胰酶，并轻轻吹打内壁上的细胞。. W+ t& L9 M. q9 j" ^
（5）将内壁上的细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大，3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧，呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧，也有人吹打5-10min。
7 X$ t5 S9 {9 H6 K2 A6 a! v（6）吹打成单细胞悬液后，转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。; X) b6 }4 h$ [. k" _0 [0 ]( H
（7）离心期间另外准备两个T75瓶，加上原瓶，共三个T75培养瓶，分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后，用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后，平均转移至三个T75瓶中。混匀。0 g1 N. R1 E9 A6 _
（8）放入温箱培养。
& D9 ~- T/ r5 M( y7 q(注：我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶，也就是1：3传。)

have-a-rest

有个问题，293培养基中需要添加丙酮酸（钠）吗？抗生素呢？  S2 N! P0 T) |6 Y$ }3 V
一点建议：胰酶里面添加一点EDTA，也许就不需要吹打那么长时间了。

hualin840518

good

hualin840518

图片是用成像系统还是相机照的？

mvirus008

持续关注

mvirus008

有个问题请教一下：
; n7 d3 V$ d6 q" w" w这个细胞传代能否简化一下,(胰酶消化后直接加培养基把细胞吹散分装，省略掉离心再加新培养基再分装)，不知道这样行不行？

难得胡涂-1

能不能消化后先倒掉胰酶，加培养基再吹细胞？这样也不用离心啊！

泡沫清风

7# 难得胡涂-1
5 c0 f! P. ], M/ [' Z把问题发在疑问贴里吧，这样我不用找。我的回答请到疑问贴去看吧

chenghoby

好的

轩辕之客

支持下！！！！