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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-17 15:56 编辑
Q$ c9 f6 a- Z2 B* C ~7 |# q8 _2 {# Q" G; }
第三天中午，差不多复苏后50小时左右，观察细胞& }9 z- L: |: |2 F6 [8 K5 V5 Z: R
, u3 u( I+ e* a- `% z
- U3 W9 [" i" S+ v& M
不同的实验室消化传代的方法不同，我的方法可供参考：4 w% S. \& F: b1 T" B* O; O
3 O8 o6 j9 a3 ^! ~. u& z
实验前准备：4 Q1 j5 }# [% s
（1）DMEM+10%FBS" m! f: Q" M' ]# ?
（2）PBS
1 O' ^7 s9 A D( y/ {7 _（3）0.25%胰酶
. I0 [$ D- X9 |2 I, i5 q（注：同样这些试剂要平衡到常温再做实验）
. L" `; ~% N. X( y9 I4 c$ } \" u4 c. Z0 k5 r: ^
实验步骤：) z4 I) T! z3 ^1 ?( \5 z
（1）弃去T75瓶中的原液。
3 }4 n% u* J$ I* f% M（2）加入5mlPBS洗一遍，洗去残留的血清。0 P4 g; q% _. P* I( \; ~
（3）加入3ml胰酶，大概常温放置1-2min。
' r! z. u! y- g（4）加入6ml新鲜培养基中和胰酶，并轻轻吹打内壁上的细胞。0 v4 ~0 p- L8 V* j& {' P6 A
（5）将内壁上的细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大，3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧，呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧，也有人吹打5-10min。
' u, ~1 v3 k4 _8 D. ?（6）吹打成单细胞悬液后，转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。
3 Z/ \4 j8 v$ Z2 u（7）离心期间另外准备两个T75瓶，加上原瓶，共三个T75培养瓶，分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后，用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后，平均转移至三个T75瓶中。混匀。6 Q( l( ]3 C3 t1 \( \1 j: X" q
（8）放入温箱培养。
3 P2 w* v! k# g2 b R' w(注：我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶，也就是1：3传。) |
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发表于 2009-8-17 15:46
发表于 2009-8-17 17:04
