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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-17 15:56 编辑 & v2 ^: P# x" |/ B: P, q5 K$ o: g
/ C( o! q, X8 Y$ q6 R% d9 ]
第三天中午，差不多复苏后50小时左右，观察细胞
, c: N C( ^- G6 N
" l1 g- F) x Q, I* w' x
) e0 k8 ~3 {% D8 K8 U3 G不同的实验室消化传代的方法不同，我的方法可供参考：
; Y C/ y0 S* ~6 s, v, k8 a2 \9 D7 _- n0 N* [
实验前准备：: I* {: E% D* q/ l# j2 t0 \8 ^" f
（1）DMEM+10%FBS
- c) o+ o" R, H3 h& ^% Y) u（2）PBS
4 _4 P( k5 f G（3）0.25%胰酶+ A. k' s3 n" E2 h' p
（注：同样这些试剂要平衡到常温再做实验）( Y$ N) @% k+ G2 r% c" t
3 ^' [; X9 b/ `8 f实验步骤：/ v- V& z$ I7 X+ G
（1）弃去T75瓶中的原液。
5 K, v) r9 F2 A' [: i2 j（2）加入5mlPBS洗一遍，洗去残留的血清。
/ {( j- `4 h- o6 ^（3）加入3ml胰酶，大概常温放置1-2min。
* e! V: K3 `# q4 ~# j, A( Z! @（4）加入6ml新鲜培养基中和胰酶，并轻轻吹打内壁上的细胞。
% I" f/ ]- W, F0 t, `: [（5）将内壁上的细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大，3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧，呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧，也有人吹打5-10min。2 [4 ~' B& ~+ h4 Y+ {
（6）吹打成单细胞悬液后，转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。
; M8 C$ E9 M1 l% E0 `2 H（7）离心期间另外准备两个T75瓶，加上原瓶，共三个T75培养瓶，分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后，用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后，平均转移至三个T75瓶中。混匀。/ L5 N5 J) l9 W
（8）放入温箱培养。' r k5 b: H. W+ `1 ~
(注：我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶，也就是1：3传。) |
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发表于 2009-8-17 15:46
发表于 2009-8-17 17:04
