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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-17 15:56 编辑 ! z; ?+ J q! T8 ]9 h, \5 Q7 W2 d* q
$ I5 o: N$ {9 P) j* l第三天中午，差不多复苏后50小时左右，观察细胞
- |- V: ^7 p4 o% ^. D7 ?
& `( h( K1 v2 e: \; p. A. s/ L" G
' ^+ G9 S0 ]( v9 X; g3 ]8 S7 G不同的实验室消化传代的方法不同，我的方法可供参考：
- T- h1 K0 N5 U( u( }
$ P( @3 k8 }# k7 F实验前准备：
6 G6 g b; ^# J% G/ y（1）DMEM+10%FBS: ?) j! u' O7 h8 e8 k- N3 A& f+ r
（2）PBS
! }) I0 _/ e9 m5 Q（3）0.25%胰酶
3 E3 v6 Z8 r5 z+ Y# U0 I: A（注：同样这些试剂要平衡到常温再做实验）
3 A% Z: H" w* x2 {% b. v/ P) M! M8 |( C+ C/ @/ G
实验步骤：
1 S3 Y9 t# K; u N( z" }' ?9 T（1）弃去T75瓶中的原液。
# O1 f' N5 u0 \) Z2 d% g4 y（2）加入5mlPBS洗一遍，洗去残留的血清。. `0 ?. J! |3 H3 M( Z& v
（3）加入3ml胰酶，大概常温放置1-2min。
" H! o g0 F0 c, k& L2 x（4）加入6ml新鲜培养基中和胰酶，并轻轻吹打内壁上的细胞。/ {" m& a! t, m
（5）将内壁上的细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大，3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧，呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧，也有人吹打5-10min。! ]$ X9 W# Z$ Z9 P+ @' l
（6）吹打成单细胞悬液后，转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。+ e& F7 F# q. e' u4 }* I
（7）离心期间另外准备两个T75瓶，加上原瓶，共三个T75培养瓶，分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后，用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后，平均转移至三个T75瓶中。混匀。$ k" q" y% S' N6 ^
（8）放入温箱培养。; z1 c# b1 E3 o, h P3 ]0 o
(注：我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶，也就是1：3传。) |
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发表于 2009-8-17 15:46
发表于 2009-8-17 17:04
