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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-17 15:56 编辑 ; \+ P$ d$ I8 f" E8 E
/ E& |) @9 g% _7 h% b! r第三天中午，差不多复苏后50小时左右，观察细胞# G7 v- b- K7 s" U* x
" d8 F# q/ @/ m, r/ M
; B0 C( n6 d/ \& i" M' v3 \
不同的实验室消化传代的方法不同，我的方法可供参考：( _3 _( Z0 D' M% Z) B8 n( Z* m
3 x- ]6 E D: e! F. C4 [
实验前准备：0 g0 k) ?: p7 D# Y
（1）DMEM+10%FBS
`. s; c' V. r（2）PBS
7 r2 l0 O3 h- {( B" Z（3）0.25%胰酶5 o: K, V4 {7 f
（注：同样这些试剂要平衡到常温再做实验）& a: ?8 p: m( ?& x
; [$ a/ G8 O k
实验步骤：# ]1 [2 T2 u8 l
（1）弃去T75瓶中的原液。! y0 I. f; s5 O" E B* [3 }/ v4 r
（2）加入5mlPBS洗一遍，洗去残留的血清。; S: ^& ~& o3 P! [' F; F5 S) g
（3）加入3ml胰酶，大概常温放置1-2min。) ?3 z0 ]" j2 N# G+ B
（4）加入6ml新鲜培养基中和胰酶，并轻轻吹打内壁上的细胞。
% M$ C( p# G. ^（5）将内壁上的细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大，3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧，呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧，也有人吹打5-10min。& S! d7 _3 ]& g3 l2 V0 O& y- K
（6）吹打成单细胞悬液后，转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。
2 y1 Y6 B( |2 t/ g* K（7）离心期间另外准备两个T75瓶，加上原瓶，共三个T75培养瓶，分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后，用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后，平均转移至三个T75瓶中。混匀。, b4 v" U& J% w8 f1 @& O$ U
（8）放入温箱培养。8 o* E. ~4 I, P) Z% j4 R: w8 g1 ]
(注：我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶，也就是1：3传。) |
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发表于 2009-8-17 15:46
发表于 2009-8-17 17:04
