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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-17 15:56 编辑
. |2 P0 s1 d7 R' s0 r
( O3 z' h1 ]6 n/ S第三天中午，差不多复苏后50小时左右，观察细胞
7 a! c0 B1 Q, n* P' }
; Z! S8 D3 b/ V5 B' l- }; X0 R1 h: {
不同的实验室消化传代的方法不同，我的方法可供参考：; |3 u8 c+ c' y# D+ p- A9 h
2 L; {, _* ~5 z
实验前准备：
2 a9 \: f! p1 K6 j0 G+ A9 ]0 K7 Q* H（1）DMEM+10%FBS
3 v v6 u; W0 {* D, ^0 D* P+ x2 g（2）PBS
( A4 m+ C8 ^. Q8 `! w; g/ e（3）0.25%胰酶1 n4 f m( b$ f: L% \: b+ E f- g
（注：同样这些试剂要平衡到常温再做实验）: g: R; ]1 H+ g2 w4 { h
* Z2 ]& e: L% A* r0 }. E2 I0 H实验步骤：% u( f4 g ]# }% B. N) v! P8 |
（1）弃去T75瓶中的原液。
4 r" ]1 m2 ^8 @! H; X, X8 \（2）加入5mlPBS洗一遍，洗去残留的血清。. c, L7 c$ [: e+ A
（3）加入3ml胰酶，大概常温放置1-2min。1 e) z* T6 Y+ M
（4）加入6ml新鲜培养基中和胰酶，并轻轻吹打内壁上的细胞。
8 i# i. ]; G5 ]2 m（5）将内壁上的细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大，3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧，呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧，也有人吹打5-10min。5 Z5 D( ? t* z) w- U9 e( u% M; j
（6）吹打成单细胞悬液后，转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。4 O ]4 T! ~& v( }/ q- J
（7）离心期间另外准备两个T75瓶，加上原瓶，共三个T75培养瓶，分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后，用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后，平均转移至三个T75瓶中。混匀。7 I5 c8 {' c/ ` b( _# k
（8）放入温箱培养。) ^0 t/ e% F+ z* I2 a+ d" X% f9 k
(注：我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶，也就是1：3传。) |
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发表于 2009-8-17 15:46
发表于 2009-8-17 17:04
