如何用PCR扩增长的片段

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；4 a: v. h; A2 a" F" G6 j0 t
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；) c- S% {, X6 a6 P" `
如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。
+ f% A# D/ S) b5 k" e最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！
! s. H% w% e& J8 w! H% m本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger
' U  H6 G9 X# p' T- g7 s4 `另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
9 K7 g# M* \1 q' v" g首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；6 L+ [$ ]& u4 L% O% G
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；+ V2 n' f- y; o7 G, z
第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

weiyepan

回复 chenhuachen 的帖子8 H- k( c4 n$ t! f5 C  u
; u8 j, W6 ~4 _3 d5 L( ~
是的

weiyepan

回复 julia20 的帖子8 u$ q! W* h9 `

3 L3 h: |& ^! N& S0 t7 h/ h1 ccDNA一般很少能转到5k以上的，一则反转的体系不行，二则常温合成RNA的二级结构影响很大。基因组用Taq好扩，这是公认的，而长片段Taq又容易引入突变，所以在基因组里面拿长片段不太实际，只能分段扩。

weiyepan

加点betaine，初始模板多加点，循环数+5