如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR& Y# D" o. P9 V) k9 b' B
会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈/ f5 z# `) W6 B% e& H
但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

. v% C; p* s6 J, x6 S8 G+ W4 f! b" b
: B4 `9 s% ~' w: ^  T  w% c$ n
选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；
3 @0 ]# e8 v6 _& D: v9 l: g如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；/ K2 V% j+ X! M& O" S! y; O4 _
如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。0 t3 _. w9 k, i8 A
最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！
9 z' R) J3 {3 r- @) F% |本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger 0 W1 J  D3 c, o1 e7 y, h1 p
另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
: e* O5 N9 }3 ~9 l, @  H0 P5 S0 o首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；& }, H9 [5 ~  B  U0 L
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；
5 @1 F' E/ t! U# X8 i& ^第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。/ j6 e' Q7 n5 ~) H& e
普通 PCR反应：
7 X; A- \2 B, c" w: B/ PTaq DNA Polymerase - c3 {5 i% Z8 i* o
rTth DNA Polymerase
! a! ~7 h. j+ N. Z/ O高效率 PCR反应：
8 r: ?" B9 A0 K" }; wBlend Taq
3 P8 t) q3 ~, l6 P& fBlend Taq Taq-Plus Plus-
. K6 L# O7 i1 P9 d! ^5 z! cKOD Dash (LDP LDP-101)
- f9 E( G# [0 r, u4 I, F7 SKOD KOD-Plus Plus-
4 [3 u- T: p) W/ L" cKOD KOD-Plus Plus-Ver.2 2 |4 d, L; Y9 z2 `% a6 k
KOD FX   r% l4 ^8 q! A& U
高保真 PCR反应：
. b+ {) }. S: y/ M; DKOD DNA Polymerase* ?* D3 u7 ^) h# |$ ~0 S9 F3 i
KOD KOD-Plus Plus- & _& }5 d2 A% z" x+ A
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2 " I; X+ O0 g' N( ~! c0 X. n
KOD FX
! ^: y; X3 q. v% F% E( P长片段 PCR反应：
  H2 [. u4 i8 `6 d: T! s2 l% WBlend Taq Taq
- N: E9 w' p  ?Blend Taq Taq-Plus Plus-
$ J" [- I; Y) [; r9 cKOD Dash
/ A0 n9 Q& T8 ~, m2 G4 KKOD FX

exin11

学习了