如何用PCR扩增长的片段

chenhuachen

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( c0 @0 a, H% v; P2 A# w6 }3 K/ v$ L* i4 m) W) N) ~
你好，想问一下第三条中“逆转录文库”指的是不是cDNA？

julia20

回复 weiyepan 的帖子) V9 l3 z6 @7 G3 U$ a2 ^- l, r
+ K% b1 J, K6 r7 O0 a) R) x
长片断是在基因组或者是逆转录文库里面是什么意思? 这些不好做, 那在其他什么情况好做呢? 谢谢!

weiyepan

回复 chenhuachen 的帖子; m4 [& q! Q1 i6 p8 [4 T; O! t; {

; ?& a2 v9 ^  S是的

weiyepan

回复 julia20 的帖子! n3 u3 n, d" o  e+ r1 S
/ l* u# M/ n" Z3 D2 e
cDNA一般很少能转到5k以上的，一则反转的体系不行，二则常温合成RNA的二级结构影响很大。基因组用Taq好扩，这是公认的，而长片段Taq又容易引入突变，所以在基因组里面拿长片段不太实际，只能分段扩。

石山巨石

7KB 不是非常长 可以直接做的 不用桥接

zhucexiaji

7kb不算太长，你可以在NEB, TAKARA等公司选择他们的长片段PCR酶来扩增，引物设计按他们的推荐要求来就可以了，简单的很，不过模板质量要求要高，呵呵

yiyi8909

公司有卖专门扩长片段的酶和buffer，注意dNTP的量要相对增加

碧螺春的秋天

用KOD高保真酶，不用桥连，直接P就可以。如果条带不特异或者不亮，可以梯度PCR摸一下最适退火温度，循环数不用太多，延伸时间要足够

chenhuachen

回复 weiyepan 的帖子9 [3 x% Q2 @/ s( Z' i! i1 g
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你好，想请教一下：我最近在扩TP53的全长，用tiangen的hotstart taq酶扩增后条带很弱，怎么办？是taq酶的问题吗？另外最底下的引物二聚体比较亮

weiyepan

加点betaine，初始模板多加点，循环数+5