如何用PCR扩增长的片段

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；
& t* |- X+ K! D4 Q  P9 K如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；
4 J  v/ s& ?* j8 [/ ?$ [如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。
) u' E& y) H* H# |最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！6 D2 w9 r6 g; r( |( l% h+ Y
本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger ' w, y) F! {& B9 P) N
另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
( X4 P0 Y2 u( ~4 J首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；% I5 F' u; Q. N4 E4 v1 O- P0 @. F
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；( U; k& Y; S9 P( J
第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

weiyepan

回复 chenhuachen 的帖子
8 ]: A4 x! @. X5 l. Y
. H, h* [+ g( L7 L8 p" y" W是的

weiyepan

回复 julia20 的帖子
  t' R3 ~9 ?! }$ B  U+ {3 L1 p) B# e3 p1 c
cDNA一般很少能转到5k以上的，一则反转的体系不行，二则常温合成RNA的二级结构影响很大。基因组用Taq好扩，这是公认的，而长片段Taq又容易引入突变，所以在基因组里面拿长片段不太实际，只能分段扩。

weiyepan

加点betaine，初始模板多加点，循环数+5