MSC诱导分化专题

dfe77

样本:$ `& ?+ V. a# U. ?7 ?' v
MSC向成骨细胞的诱导分化" j: J* Q) Q3 z$ ?8 N, d' q0 a! P
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
5 u/ Z2 a2 X7 C; N, z' F(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；8 ]# J% d7 K  o4 V6 i# u0 {
(3)2w后进行茜素S染色鉴定。
! B+ V! I) q' o. R' J3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化( m) z% ^2 ?# O3 E! K
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；. @  `2 [  v) J/ O" p
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；1 k2 U. x+ l5 |) }4 Y
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。
0 m7 ~. X' ^9 V! oMSC的成骨和成脂肪的检测* e3 m  F# ^. k* Q/ i: {3 y& h/ C
茜素S染色方法
+ @9 T* Y' H! ](1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;
* Y5 J1 [$ B- r  p2 j. u9 N9 w- Q(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；" D6 O. n& y( E1 h! Y! u
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
2 e0 N4 b! \( s; k+ x: Q2 d: J苏丹Ⅳ染色方法4 a$ f0 ~! w5 [" f: h
(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；
2 N8 x. ?  f4 j( J+ V2 K(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；3 A$ x: ?  Z6 K' L6 P5 r) S
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

dfe77

成软骨细胞的诱导
6 b$ {- U4 O9 `* {; i5 T5 k选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接. g2 D; y0 Q0 f- ~; u! W8 ?) p
种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
: m; p( P2 D  E- v软骨细胞诱导液:5 k- N. Y4 v# Q8 ?2 n  q% M  K
DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF/ k) J7 q% w. U; |% g8 q: @- l
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

dfe77

体外诱导MSCs向神经细胞分化: _# t' }9 W5 b- X# W) k
体外诱导MSCs向神经细胞分化
6 @; g' U: B( t, F取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
) O4 i+ V3 Y  d2 W' a! M& s9 ?  S的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs
) C) |! S; D% p  Q2 v的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
+ Y8 u' u' e6 V2 k5 P& g1 S, E后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

dfe77

选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
# t+ `: L3 K8 G, y: c成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
$ u& _& J3 u$ F/ [/ w8 y茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
: |4 O) a7 v; {* L9 t0 ]6 B
6 j6 M/ q+ O5 N9 b1 [成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
/ T' H6 C4 x4 j5 c油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

dfe77

肝样细胞诱导分化[1~3]
$ K( {1 U/ z6 xDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达/ [  B0 y: Z! o# q/ ^: u  V- l

) j& G. U7 ]: |; m1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
; U& K4 U  W: r! Y+ d2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.( W. p! l, F& G# P8 q; _1 O) m% L
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation) m2 L( Q) o' P7 d- @1 x1 s# x# `
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
1 |4 L' }! n4 I/ I7 ]- V  d; b% f3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

dfe77

2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化7 Y9 S. b9 |! ^" h- O/ [0 b
2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞$ r, b3 P3 R+ r8 g8 v* d' B9 B4 T
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
) n$ h7 P2 ]1 ^& E$ ?2 s茜素红S染色法步骤：+ s& i! W  r' ]
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次, X8 q& `! a! r+ C
(2)茜素红染2min。
8 ~+ W1 |, G" y2 q& C7 ?' f(3)蒸馏水洗5-10s。& C6 r/ P; z6 ^. |1 N
(4)分化液洗15s。- ?3 ]' p! Z) ^8 p3 i* Q& Z
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
( B- Q) |: d: [4 C! |5 g2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞' ]1 z0 h" e# S$ i/ l* v! a# A. C
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成) S9 s! L1 Y# J! q6 i4 A
油红O染色法步骤：% q' J6 h) B. d; h1 l4 A; p
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
* ~7 H9 w; H& a(2)4%多聚甲醛固定15 min;( j; d: @1 f- Z/ ?" M
(3)PBS漂洗两次，每次5min;
. T8 @" d* v# S4 l0 M! N4 I& [(4)入60%异丙醇漂洗。
5 T8 Y- f2 @5 d7 [6 p(5)入油红O染色15分钟。
, y; r! _5 }; |* u* z& c9 i* D% LDevil60%异丙醇漂洗。) m6 I: F) l$ z! @0 d- O
, _& v: e3 H1 H2 o' R/ t
3.rMSCs成肌细胞诱导分化
$ O& H8 o' Y/ S/ P* B以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。& Y3 o' {1 L9 Z0 m' j$ @" `
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

dfe77

新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC; T5 _0 L) Y% R' i  D& J! t
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
7 O2 w# \6 G" Q& e! e# x" j1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
* S" t& V& \2 [) H, }* k2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。
  B9 o! N& H7 c! O' R3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。
! ^" Q5 N" u, S2 G. V  W  H4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
$ r* z& U! [  t2 n- h& I+ A5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
& A* R0 J; F) l+ n0 c9 `6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。) k4 m0 k1 g3 M* \9 |: p3 ?
7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。* P3 p5 j8 [' L0 {
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。7 s" o# K6 p# ^
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。
& h# W) ~8 C6 S7 t二、诱导分化实验：0 _1 Z; P2 z6 s' T# m/ ?+ C6 {
取PP6进行诱导，采用两种方法：
$ L, [1 {1 H; `) O) ]+ u2 V6 B: a, e* m  d
1、共培养诱导：+ N3 n3 n% z: S. m: v
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。
! Z! F, P8 g* w' o% S+ u另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
) E7 k. K; y5 t& [1 D2、直接诱导：0 N& w) E& o5 o% Z. t' i) Q
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。
0 ~0 N2 R" o- m" j: ~0 M+ x同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。9 m; W. }# h8 ?: q( b* [
7 s& P$ z3 Z1 V1 h8 }
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
6 j( O/ q9 ^( H9 L" h/ W3 t( M: w# @' k6 o* _5 |! R

* Q7 B, {" N; H4 M6 FQu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

dfe77

CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:: Z0 N( z& @5 q( i
细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,  _# \, G& U7 U0 [- b5 v% v
GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

dfe77

脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞+ r5 I" z1 T- E3 S) E: G
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞( `. N! t# `0 s; c/ c2 [+ w; p/ C3 Z

* ~5 L1 `. t# [. E  |+ U1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
) i$ x+ Z3 I) Z' K! G" x! @4 P- @
3 d6 ?5 g2 r! V& P2 s. k2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
8 r$ E8 b6 l4 `- P
  T2 D8 A- c* s0 Q' C( r0 n8 s# N9 s3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。- K7 q5 A5 C3 [$ i! V" k0 H% f0 `
! ^/ p, M  h' l3 U
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。( s+ u) A. `. A) s9 j
. a6 `1 L$ K: X
5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。7 ~; j5 Q6 `( j8 ^% b! ~* |# Q
" L2 A2 f# `: f0 Z( h/ i, P
参考文献：0 e& ~/ Z, m! G3 Y9 j! `8 ?$ i
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
( m7 F0 R/ @+ b% e, B: w2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

dfe77

zeronepl7 D9 z- Q% g! W
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化
2 [# i4 ]! j7 D9 z" M* T诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。
( g* l/ O) x) |0 A- v6 I1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化3 o1 J! C* E% O6 C+ {- i
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。
: Z( E3 E" m7 A6 x. v: l- z$ E1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化: e- S9 D' Q' y) ~1 i% e, \
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。, S( w# D4 g( S) F" s
1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
" m* i7 e9 m) F3 {% W5 U# p! c诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。, Q! k7 X3 p+ U& G
1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
: N( o2 ]% D. k  r7 Z& {诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。
' L, O- e9 t) {* w* z0 n1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
) }( T/ d6 d- k' J1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化1 t$ J# ]4 k- [% t1 i
诱导剂主要有5-氮胞苷。
' c+ `1 ~. P% K! N! f3 @) B1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化! M7 y8 r9 f# n3 n! v5 \) N
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。