MSC诱导分化专题

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样本:
/ j  I$ s& l5 |' KMSC向成骨细胞的诱导分化
7 x; e6 {: w+ f. T. J(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
1 X2 d- R9 y, g5 q4 [2 t0 x(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
$ Y9 z: L, S& v0 O5 z(3)2w后进行茜素S染色鉴定。
* L$ A' ~2 j1 c9 w2 W: g# c; C+ Q* h3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化  l5 W& x7 F. u$ r8 {  O% a' t- z# W
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；, t5 M$ T. ^- j. J3 [$ `
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；0 u% ~7 V' U: y/ B: _$ U
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。
- U! ]3 e7 `5 h, A% GMSC的成骨和成脂肪的检测
9 X9 `, w, S4 w9 C& o6 {4 p茜素S染色方法0 W2 Y% X. D# s- p
(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;. `  V5 y9 L/ b6 [4 W9 J
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；& W$ V& S- N& j+ x4 {
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
( |. v: t  D+ Z- t苏丹Ⅳ染色方法
5 K8 D9 [' O# k% c; |+ F(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；9 [( @, T" V* h6 o  \: T
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；
9 J' n4 m! x9 H& k+ m(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
; S6 z/ C& J' M; m选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
) w4 T6 r0 d7 q5 E& q种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
& u6 ~3 Z& s% {% v软骨细胞诱导液:
" I8 ~& {( i9 Z/ s) v; fDEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
3 a/ ?, n- {  a. A) x- ~-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化
( z1 |# k; t, y# }体外诱导MSCs向神经细胞分化
; E  S- a( C$ ^# q. l: {4 M7 }3 V取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片/ Z3 ]+ ?$ e* d
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs1 N7 p0 g8 D0 l6 F
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
, f. n  k1 _+ h2 ~) t$ p  I% ]  O后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
- X7 B6 G( q( H2 b) O0 b成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
# ^& e. K! B% P8 `" Z0 p茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
( X: S% ]& O; W$ o
  o! K# c1 c6 x0 k, h4 C& ]成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
5 e. S1 @! N6 O. n8 m油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
/ u0 T: N1 i8 R. m. j5 L0 D1 NDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
& Y! ?) e3 A5 c, j7 Z) I& {" ^6 t3 e- v# Z/ y2 r4 b8 e4 u
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
; x3 L3 N+ u* ~/ z3 |% }2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.1 |+ b2 ?0 R" P
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
$ u5 c  F9 M( o7 u+ q0 l- uinto hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329) ]+ |7 F+ T/ L' k6 T0 T6 S
3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
# f3 \/ x3 \- k$ }5 k  Z2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞5 r) J3 `& y1 B2 Z- _
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。( b" C! r0 N. Q3 B/ ^' s; C/ E7 v2 F
茜素红S染色法步骤：1 S6 s: Z7 N' o. z
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次
4 X( H- J/ w4 ]8 I) P(2)茜素红染2min。
& E1 M) J, G0 n+ g- ^/ h# Q. o& l(3)蒸馏水洗5-10s。: E4 a) @9 U6 [* r+ B+ P
(4)分化液洗15s。
% P! _. Y8 k  M* `(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。# q  b0 }! d) @1 o) `
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
* H5 @/ N0 r0 [  A1 d* I, m# \以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成  U7 A5 D7 }  M5 A) s3 R9 U9 \
油红O染色法步骤：9 N- w) v2 F' f* Q
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
" e$ ]' Q% p5 y* `' b, q# X  E5 k0 q! k(2)4%多聚甲醛固定15 min;
% j9 J! ]9 S9 g4 ?  C(3)PBS漂洗两次，每次5min;
, z: q' z1 @8 S: z5 s8 n4 |; O  B(4)入60%异丙醇漂洗。
- C' Z( M  \2 k" L5 J(5)入油红O染色15分钟。4 d' }; a$ F: P
Devil60%异丙醇漂洗。6 X+ ]8 Y% f: ]/ e
: g) o9 K9 I# q; Y
3.rMSCs成肌细胞诱导分化
5 k& ?' l1 E. n+ p以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
0 i  S' l/ q1 A0 ], U参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC
4 Q, ]% p/ @$ i4 d0 R" i一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：9 i$ {) h' q  C' \; |
1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。; ^' k. F# t2 e9 j( t
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。8 K  t& s8 k9 h! T) p: X9 ?
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。  P- ~. a& J( o0 u( i% h! `  x! _4 ]
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
3 H- u& {, f) J$ H) v5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
- A% Q1 @3 n/ Y# q4 }6 {1 D5 g6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
( x% W0 j% W# [+ J; r' q4 H7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。+ \) G) W! q5 C& W# h7 O: p
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。% A( l+ O2 X1 [* Y" [  d" v
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。
: I0 N* x& q( @二、诱导分化实验：" V' I8 C5 g9 m' y2 I0 D7 z
取PP6进行诱导，采用两种方法：
% {1 Y, Y, w2 S9 X/ e
3 X# o7 f7 ?" y4 r1、共培养诱导：( X8 x+ x+ H' b! P
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。
# d8 b! ]( b$ D另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。/ B  u' }: k8 L, i; a! S. E0 z% D: T
2、直接诱导：8 _2 }" X6 _. U
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。
4 r! [- A8 h3 Y# O( p' E* m  o同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。$ j, D0 c, c  F7 n; x2 w: m
5 J. t' n( t; v0 ?
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
- f2 v1 i/ z, \1 b7 a8 u- u9 }8 e  Y8 ~$ ^; d5 {, o: G3 ^' a

1 o; I0 ~, \- EQu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
7 u0 `  v/ f: N, U% D/ a4 J: A细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
; L& k! `# h1 }. p- t) H. ~GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞$ J3 u, V- I7 A
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞1 M( X! z) _  B" T2 R4 h

3 T; B, B: w5 d  E7 ^1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。, ~- z* Z1 p) l! e
  g+ q* S+ I+ J
2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。( F$ E, h* D" q; D/ b
7 W7 [8 A' C! d& I( h* w1 Q9 c4 F
3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。
% b  {9 w6 x3 }
8 Z  ^9 n3 K; y4 e; e4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。* v- d/ J9 P1 P( k2 g

4 y2 D9 I" J( k% ^, P) R$ H$ k5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。
9 y0 n3 t3 m1 D& m6 @
& a) J$ X" j" Y3 n参考文献：! C7 \+ _) @- w0 U9 e9 M3 D
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.$ z" o1 A4 o  t) G. {
2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl$ P. p" T: r7 s% F4 C9 G9 K
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化
4 c' I; R! O, e诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。
$ X2 G5 A9 P* W, v4 i, [1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化: h- T  P& y0 Y: t
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。
$ r' v7 q, L) m3 Q! A1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化
" d, W' I# O2 N" P& a  P, w& m/ L. m诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
0 k+ Q! c6 j" Y: h- L& ?1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化) Z( Y) c* }: c+ ^2 l' o$ y% O3 T
诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
) s- D2 o$ Q+ }5 X, y* R" S1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
+ B+ T* P& U. ]* p诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。3 a, a& a- u# }
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化# x" n7 C" {( d- v0 s6 }
1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化" w6 L+ a" \$ _+ Q! i+ d: v# B
诱导剂主要有5-氮胞苷。
$ V- r6 b7 N' r& T1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化
4 {0 x( f6 k- }( g2 ^6 @7 m& z诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。