MSC诱导分化专题

dfe77

样本:
/ a+ V8 n$ W2 ]1 A( ?4 n5 uMSC向成骨细胞的诱导分化% T+ i& D9 k2 _( k5 i7 J
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
/ |2 m6 r& `' ]- T(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
% |' t4 q- [: l  V' \4 P(3)2w后进行茜素S染色鉴定。
0 _' Z5 [1 F/ |* j0 A3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化
( M0 m2 L6 e, g: I( l4 A6 H9 f(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
0 D3 N& O6 E2 D1 ?* z( |' W* B" K(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；$ c$ P* j3 f% I
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。
# D( H0 L( C* L8 o# Z. ~( ]MSC的成骨和成脂肪的检测
" v, K' }2 h0 H1 q2 L6 f茜素S染色方法
* J' ^. T+ m7 _& z2 j(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;+ V% r# I, t. I" P* ~3 r
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；
9 f/ v- A5 ]& @(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
+ F+ Q! o( {8 ~/ ?! L苏丹Ⅳ染色方法3 b7 M9 @6 `& \0 l+ k8 y
(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；# B: q& \" m8 ^; C! U
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；
( x' @( e% I8 o(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

dfe77

成软骨细胞的诱导' B9 ~3 B% Z# k0 o# E1 d! h
选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
( M$ p1 G. P" M  j. C. w种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
- d) o; f/ N: N" ?2 R% o" d软骨细胞诱导液:, K7 J- n$ F$ ]: ~( C! W# F
DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
; t* N" ?4 `( C/ U" i, o# Q  k& c-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

dfe77

体外诱导MSCs向神经细胞分化
2 _3 p8 r* j: A  b$ z- o% g" W体外诱导MSCs向神经细胞分化
+ g0 c$ h7 t: N. k$ U取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
  ]3 f8 T. b) v/ Q; k: u的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs
1 I8 m5 \. F0 f- p的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
( \6 Y  s9 q$ r3 p% J4 M% n后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

dfe77

选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
1 b8 C( _& V: V/ _$ x成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
: i2 ^+ O! Z" w茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。# K3 A9 z$ u# t

- q0 t) |0 S4 k$ ]5 O( i+ \成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
. C' _- M2 k4 E* {+ W' f1 W; X油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

dfe77

肝样细胞诱导分化[1~3]$ S7 b+ R# n! [% M
DMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达6 r6 u! _1 G' W  @& |) |$ _
. M* H4 ^4 @! g" N# @
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
8 L: o# F- a2 G8 |  U# y2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.9 ~: r2 H/ ?) [" q
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
+ _+ S; }5 s8 |$ l0 z1 o% U  ]! q4 iinto hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
3 Y, ^2 t2 w3 u& b2 N) Q, j% E3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

dfe77

2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
/ k9 o% _$ I, V/ i( B# k2 G2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
- ~, W6 A( Q, m$ w1 c4 _以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
5 d8 ^- ]# b  u8 X茜素红S染色法步骤：' {/ C0 |0 P" }9 W% C) G* V
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次" ?7 p. c% ]+ e/ ^# O: q6 b; Q
(2)茜素红染2min。/ u) b8 \$ \) X7 I6 S/ b3 G
(3)蒸馏水洗5-10s。% w: c; k  I1 R1 @
(4)分化液洗15s。: K8 x. `: b$ w# \5 ]
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。% D' U% G3 ~9 x) D$ d& c1 V2 E
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞6 [$ }, K; x0 ?, w8 g  u6 o, G, }  ?
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成
* R7 l+ a/ @6 @/ h油红O染色法步骤：
" s8 _7 O- D& F2 c(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
! ~# g* i% u, t9 c& v1 P4 ~(2)4%多聚甲醛固定15 min;
$ o0 P! _/ `. X/ e(3)PBS漂洗两次，每次5min;
; M5 t' ~" Z2 l' r  Z(4)入60%异丙醇漂洗。/ a( H, G" y; G& t. C# q0 E
(5)入油红O染色15分钟。
+ A* B, {' V, m/ E* z8 R  T0 i- YDevil60%异丙醇漂洗。
+ A* {; G7 K, p& P% G
" N4 c* |, ?3 ^7 b3 S3.rMSCs成肌细胞诱导分化7 V* I% v8 I% H: S3 J9 x/ ^
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。/ K7 U- S& Q9 f5 m& R1 D
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

dfe77

新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC
9 c; N/ M6 h3 Q" Q! ?8 J% z8 F; u一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
# P; f3 t+ p) v( U- ^$ N- [1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。" _3 x- S) W  B4 w8 z. r4 P  _
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。' I' D* m- m0 E$ K- |
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。
7 ]* S4 W. M( y& J4 n% g% z; n4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
, R1 K  e7 q* \  `; y5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。( x/ L8 r  U; U5 x/ F; e
6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。& o- M1 p7 v  y; u8 j( H
7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。
' m) `9 r+ e1 U8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。9 V0 ~7 Y$ O$ {/ J3 C
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。3 N0 H( y0 `2 Q: o, l* t! h
二、诱导分化实验：
) _. \7 |; Z3 V+ h取PP6进行诱导，采用两种方法：
1 R9 O$ G% e' w2 x, ?# p, x1 X$ }: o) a) g  X% h( \& {( b
1、共培养诱导：
$ G. m, w( N! `细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。3 s4 Q, A9 Y7 |7 s6 K5 O
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。' G2 P4 \( Q' W- R( W' i
2、直接诱导：6 p, |9 Z/ }: ]1 j! p: s8 j$ ]. G
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。
. V0 z, ^% u. B* b# z6 T: r同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。+ X7 T/ \$ ]% e7 F$ _! @
* T) U+ s$ H8 ^: y1 a& D) d2 D+ h
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
9 f( M8 r' R' {) y6 g5 f' Y/ h, G- P
" d9 }+ U' G( Y7 T/ f( J
5 T; C) b; D/ i2 cQu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

dfe77

CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:6 I7 a6 U' B# K) o5 q
细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
4 B' {; q  {3 t6 a3 `* U$ ^GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

dfe77

脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
7 x% S" j8 {* qx123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
/ @+ i; o" D/ ]* H# h0 q. K! l. A: H1 g, v, u' U& m5 R( ^
1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
$ k4 N; ^: \$ l/ R2 _) W$ M* R( @2 _2 H( r- J# w* i' G) G* C
2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
- F! w8 d, M: d0 |# k' v4 `
4 E$ g9 J! O4 _1 k. Y$ p. d# r1 F3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。
0 M' e, p; t3 r# w
8 O6 O* N+ c$ r4 ^  Q5 }4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。# B( a4 J9 u& N9 i' L. R' w

+ f% _: X) {8 X5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。, t1 [# b( p  Q+ [6 E4 b. [
: u, a- S( u3 W
参考文献：
3 k( T5 `  [' `, `3 j1 {1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.4 M. u- o; n& U) |  F
2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

dfe77

zeronepl# X9 U9 e* L' Q: O  Y  Z
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化- [$ v3 Q2 V# h% G  ?  h  ~9 r5 U7 N, Q) u
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。: \# d: o) N# a4 E) ]) e
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
/ k) U. C, D. X诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。' X7 ~' S8 V+ ]# p- w0 n
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化
( E' ?) Z. j9 P+ t9 G# |' _诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
3 m2 ^% ]% M& I; V7 I, B1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化3 Z; J5 r0 _6 Z; z+ Y0 u3 J
诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
: h/ y, Y/ L" a* o# \1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
. [7 j) u" G3 q- m' |- p4 C8 V' `. q诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。& Z0 J& G1 p+ J/ T) \8 P+ G
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
- [' K+ s+ h8 e$ O9 G# l8 ?1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化
* x0 e" {5 q" B5 q* ^, x! d% d诱导剂主要有5-氮胞苷。
  U  Y, u9 d- w4 H1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化" ?  W. A0 T5 m% F
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。