MSC诱导分化专题

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样本:
5 |( S4 p+ _9 }. m+ c% `MSC向成骨细胞的诱导分化
# I; o: C4 G6 a' F: ~) C  N+ @6 i  `+ I(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
- X8 E) w" ?; f( Q  D. [& r5 ]' v(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
8 G$ ~5 T) s1 P' H1 V9 W/ g- }(3)2w后进行茜素S染色鉴定。
4 ]+ q+ F9 t2 T% o+ J3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化: c0 m1 W9 x) R0 n
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
/ c( P* ^( A4 n  Z3 ?4 }' E# w7 ~(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；" x0 c8 ?  i+ d. d2 `
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。. L3 y/ [; R# n4 {$ Q
MSC的成骨和成脂肪的检测
7 ?7 b% _4 v- W$ w; [+ s茜素S染色方法
$ B9 B/ [" y* D. N3 U" F(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;
* Y" l0 d9 N% m- M! u8 c* y(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；& z" r7 q4 e! A
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
- x, _4 A# K& X: f* J; ^% t3 _苏丹Ⅳ染色方法8 \( ?7 O9 C( Z. p3 Z
(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；" ]* G# P* _9 `9 D2 \# q" D+ O
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；( v6 P. M3 \6 f
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
) ?" a0 L+ u1 X7 |2 r0 w9 r选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接* _. k/ o! i( x8 y# R- [" T
种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
1 s% S0 X# O# c5 i5 K& E+ m2 E软骨细胞诱导液:
$ Q. Z4 Z: R2 F- G4 IDEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF1 Q% m. v( a6 `
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化
% t4 k" Z1 F% n3 E' ?体外诱导MSCs向神经细胞分化
9 q7 \, j, H- d% V( v9 j4 B4 {2 l取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片0 Z) u: k/ X$ X$ I( q2 p
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs( Y. s: m1 d; n! f
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
: Z* s2 _8 F2 {  t- f$ Y后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化- i: X, [+ O, q2 w& f/ a; D
成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。8 q1 Y+ |& T% R7 k3 g
茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
. p! W( d4 L6 ^8 a2 z9 }! C+ V3 J4 \
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。6 t0 L: x3 z7 n4 J" u/ i2 E
油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
8 V5 H# P3 i1 k4 x% L: h7 u' }DMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
3 `9 y: K7 H) S- m4 g7 ~( r+ j( S- F; \/ v0 T+ G0 B
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–40973 o: l) h3 C! q) Q( b$ ?
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
9 e" g- r; Z* Z: w( j6 @Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
+ D; ^0 K! e! g. S5 Yinto hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
# @1 X- c; n" p) S& y# p$ w5 [3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
3 O+ ?& F  e, w* U* W/ H$ x2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
# S, B4 w! R$ I( Z- p8 B以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
/ y  M/ W7 Q0 U' Z茜素红S染色法步骤：
: k$ t# s  i8 i8 ]2 e(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次# Z1 e* K, s/ H, M' ]
(2)茜素红染2min。
8 z" I& Q$ @" y8 }- {. }& }( U(3)蒸馏水洗5-10s。3 N6 V# G% x, I1 o2 B3 C. O- q& x$ K" L
(4)分化液洗15s。
# g6 t: T* a5 r0 @9 G(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。; B8 Y" k  O- d
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
, w2 m+ a9 O; ?) n5 ?以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成! ^& ^( M& c' L3 }9 l: [
油红O染色法步骤：: i5 F% g# f% Z
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
1 U6 V# Y, x- n8 ^. J' D(2)4%多聚甲醛固定15 min;- F5 h1 {0 P' U$ i1 |  n3 W" |& p
(3)PBS漂洗两次，每次5min;8 }7 {# m$ S) a" b& V
(4)入60%异丙醇漂洗。6 v7 t8 i7 L( a: F# Z! ~! x
(5)入油红O染色15分钟。* Z( V  r8 B" s2 L
Devil60%异丙醇漂洗。
+ k' x9 \; w4 U: u2 E7 N6 w* Y$ d* ~. B/ V( Y
3.rMSCs成肌细胞诱导分化
% k; y4 a$ J7 r) S以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。& P7 K( R" Z. k' w, V
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC
. T7 n$ [# H' p7 I一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：% ^+ ~/ b; d5 P
1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
& ~1 f' A4 ]8 A- o6 c- D2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。
, N; X( H5 i- d) @0 C) c& `! ?2 n! s3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。
/ a1 J0 E' I. B+ I! E! O" a8 s4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
* R  T1 j+ g( `# j  \" T5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。7 Z8 S; }' F. t2 g: @
6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。5 ?5 D8 e; L$ C' i
7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。# v4 c+ Y$ {* o+ b2 @
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
* f9 f6 w2 F5 Z3 Y( e/ p9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。
9 K7 W8 j$ R& M% ^; C0 U  S/ o5 X2 `二、诱导分化实验：
8 E! B: h2 Q6 l6 ~取PP6进行诱导，采用两种方法：
0 T& R" R1 c5 m6 F+ p* _
* s: M% `# K, q# D: P8 k: ?& n& ?1、共培养诱导：9 n. R1 L% E/ U4 a5 \! s
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。
- z8 n$ M- ~; z& N) i  ^- ?另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
; ^$ `( f( H' b- s" Z& \1 ?5 A& o: r& X2、直接诱导：
+ {* t$ D% I4 g7 ~5 a% {9 q( S细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。( l  N7 v8 I. v' g- @. _
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。9 N: E6 d3 N; r4 o# }' z8 {

3 ~+ d7 @6 z4 K6 H增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
2 n# z7 R3 u7 U' N  W
1 ^* q- P% u: z# v9 J" T3 F
6 \3 n: w; ]4 r1 M" _# eQu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:4 v7 y7 @" \6 B" x3 w' y
细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
: x$ L% C7 o; ~* OGM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞9 _7 P) i" _1 Z/ ?/ C) Q- F7 O
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞8 E% t& _. F3 X0 _; G

; r3 n; e) [+ ?) E+ B# E1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。7 i) |/ c+ B- K0 i% g& R- A

1 u& G  V, T/ K! x' W3 ]2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。, s, S) r' ?6 L% K, `  @- h

. l" I/ Y9 b* l5 D9 i6 h9 n  I3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。  k/ A6 Q& x( S
7 B: i# }, f4 \( {
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。0 Y& ~9 h) I, Q

( ]5 e, S  U& P. P; l5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。
5 {: h$ L. Q' r1 h3 j
& c. x  A; ]2 o( a3 _0 y参考文献：" h2 Y1 ~" T. R  i: s6 Y7 u( v
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
( p, b( k' _, ^( w. B1 M" z3 Z* v2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl) X1 w0 M. c! _1 f
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化
" v; v6 F* j5 |/ N9 p- G诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。
' j/ _" g6 g* J2 N# D' F1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化  Z' |) x1 `1 `
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。+ G5 J8 u, P9 F% e
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化: ]0 o/ T6 S* H
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
4 k& a* I1 b6 ~1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
& z/ k1 u* L8 E" H- R/ d8 @' x- p诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
# {* q2 y5 \$ T( D+ h; T1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化0 `7 N9 @4 g: K7 g3 ~7 }8 o* h0 Y, b
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。% }3 H# r, e* \, B
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化/ f, D9 B% W" X  u5 o# s9 C
1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化
" C5 I. _8 f' p4 }1 a8 z5 W$ u诱导剂主要有5-氮胞苷。5 d3 k3 I5 J; i+ x! C% F0 @! @
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化; D: C/ b# {2 M3 z
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。