关于脂肪干细胞实验的几点疑问

duoduo777001

下面是我们做实验时的基本步骤：
6 ]0 c# T9 B  E2 R1、取人脂肪100ml
2 ]: k7 E9 y. E: n  O7 ?6 y$ M1 u2、配制collagenase solution 80ml(0.16g)7 `8 r; o8 d' n; F* t
3、用1Xpbs清洗脂肪，剪碎，等体积加入collagenase：脂肪=1：18 N; a; ^# }. Z5 B: j3 L
4、37摄氏度，水浴，溶解脂肪
0 c0 t/ h5 O/ m/ O5、过滤，加入到等体积的DMED（10%PBS 1%P/S）% z1 l9 W6 `$ K5 q! H4 H" Z
6、3000转，3分钟，离心。取上层液与沉淀物分管继续加DMEM离心，同样转速和时间。共三次) A- Q2 c" J6 j4 @& _
7、最后一次离心后取出，可见有红色物质沉淀于最底部，红色物质上为薄薄一层白色薄膜样物质，最上层培养液。/ v+ b& v* s% R$ @: @% b" t
8、吸取白色薄膜层后，用DMEM于培养皿中培养。
# {/ U% l( H$ y+ |! j' R
9 C+ Z, W. X7 ], y' |; g, C5 N& E想请教一下，这些步骤有哪里是错误的，有哪里是操作时要十分注意的？; M# [5 q" K4 ]6 ?6 l# O" Q$ w
问题：1、剪碎的脂肪应该与等体积的collagenase相混合吗？% _/ ~/ Q- k' D* @
      2、溶解脂肪时，应该用时多少？如果根据脂肪的多少来算，是怎么样的一个比例
+ E# M) m$ X1 T& |; F. w      3、离心的时间有没有问题？
7 Q3 p, }6 u" f% a2 E+ G" s6 s      4、清洗脂肪时，需要清洗几次，到什么样的一个程度为宜？! u$ e; {% w% e$ q7 \% U: \
      5、最后为什么会出现较多的红色物质，是因为没有清洗干净吗？# t7 [7 I+ C3 W8 H$ }2 W" S& n2 t
望各位前辈赐教！谢谢！

cm11011

1.我想问下你用什么方法取的脂肪，脂肪组织的单位为什么是ml？
7 U2 d4 m. _0 j7 ?$ W+ O) k  Y% k2.你的胶原酶终浓度是0.2%？个人意见0.1%就够了，0.2%太强了。酶和脂肪组织的体积比>2：1为佳。
2 `4 c! Y$ ~2 D" B# |: B6 {/ l, I3.离心3000转对细胞损害比较大，建议你转速调低点，1000-2000转，离心时间可长一些，5-10分钟。: d' ^+ E" `& N1 ^$ f4 }& z, X
4.PBS清洗1-3次就够了，但是消化前最好将肉眼可见血管剪除，这样离心后沉淀里血管内皮和红细胞就少，不会那么红。

可怜的孩子

学习了，谢谢

duoduo777001

回复 2# cm11011 % N+ o8 C# |% S

# N0 f. Y; ~6 g, T2 r) \) C* H! @% ]* u5 k* |% c
    你给的一件很受用，非常感谢
2 k3 Q2 \# r1 g) R/ Z% `3 o+ [+ [我们是直接从手术病人身上提取的脂肪，马上拿回实验室提取。单位是ml

yuheng

1.如果是从人体内抽提的脂肪，没有必要再用剪刀剪了，因为已经是乳糜微粒状。
' e; A8 o% C2 j6 l' r3 D2.胶原酶可以是0.15~0.2%，与脂肪（离心弃下层水溶液的纯脂肪）1：1.9 Y0 n5 ?+ E6 K% x% b
3.离心转速1800g就可以。- d+ k2 ]$ R0 K6 H! ?
4.红色物质是因为脂肪中红细胞太多，如果红细胞过多建议裂红。
  J# D* y9 y3 n/ ]% S. }8 d! x3 p) V1 ]
以上是自己重复了n次的成功经验，值得借鉴。

duoduo777001

回复 5# yuheng # X# Q- U9 k! l* A- `
非常感谢！

ww2869

感谢了

xiaogongji

我用的是0.1%胶原酶，但是消化下来的不贴壁，为什么？换成一次性瓶子还是不贴壁，郁闷，我是交大医学院的学生，qq:290036556，养脂肪干细胞，还是没出来，请各位高手，给予指导，非常感谢，电话：15091057632，电子邮件：jiwenchenbaoyan@163.com

sunflower636

回复 yuheng 的帖子% E7 ]& k* R' q; \7 x4 f) X" j
8 U4 {" h8 h9 ~% N) t' A) u  W
版主是离心后弃去上层纯脂肪留然后重悬下面的沉淀吧？