本人准备做实验，请各位老师给我看下我的实验方案

chenziqiu

各位老师我是一名准备做实验的临床小硕，准备做BMSCs向神经元样细胞分化的实验，看了文献后感觉很迷茫，几乎每篇文献的提取分离方法都不一样，实在不知道咋办，我看了一篇文献用下面的方法分离和纯化，想请各位老师帮我看看是否可行，或者您们能推荐一个比较好的方法（取老鼠的最好），谢谢，哦还有，最好能把方法细化一下，因为我几乎没接触过细胞培养，有劳了+ x  K* x9 G3 t- i$ ~4 G* H$ S& x# g

" I( U; K! h, I1 BMSCs获取; m+ }  }8 `% o! H
1.1 取3月大SD大鼠，麻醉后处死，无菌操作取双侧股骨、肱骨，截断后用DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，用无菌PBS（pH 7.4）将采集的肝素抗凝骨髓1：1等体积稀释。2 x& c6 s% A/ u* |1 z
1.2 加在密度为1.077g/cm3的淋巴细胞分离液上，1800r/min离心20min，取单个核细胞层，PBS洗2遍。在细胞沉淀中加入DMEM/F12培养皿中，在CO2培养箱中培养。2 v! G' f" T! a8 {* b, i
1.3 24h半量换液，以后每两三天换液1次，细胞长满80%-90%汇合时用2.5g/L胰酶（含0.2g/L乙二胺四乙酸）消化转代，1：4传于新的培养甁中，原代培养结束。传代培养细胞长满后按照1：3或1：4传代，不同代次的细胞均用a-MEM+体积分数为0.2的胎牛血清+10%二甲基亚砜冻存，在倒置显微镜下对细胞生长和形态进行动态观察，直至获得排列呈漩涡状、贴壁生长的长梭形BMSCs。; l3 Z2 h0 h+ e$ a. f9 D
, X; {4 f" _- O+ d7 A- O1 x
2 BMSCs鉴定
9 R+ Q0 h5 S5 q' }0 Z, @2.1 生长情况及形态观察：采用倒置显微镜并通过显微摄像技术记录原代及传代培养的BMSCs生长和形态动态观察，直至获得排列呈漩涡状贴壁生长的长梭形BMSCs。
" |: D' x) w; N, I2.2 细胞表型的鉴定：倒置显微镜下逐日观察原代及传代细胞的生长情况和形态特征，收集第二代培养的细胞，用25%戊二醛与4℃下固定过夜：按标准SABC检测试剂盒说明进行免疫化学实验，检测CD34、CD44、CD54、CD68、CD71抗原表达。

helen841102

我也想知道 谢谢

decloud2009

你去找一些外国的文献，像nature 上就有protocol，应该可信度比较高，3 G. C' g8 S+ K
. b9 ?' G1 ~; H; u, c
然后像你说的最基本的细胞培养之类的，可以找学基础的同学阿，老师啊，看人家怎么做实验，，试着养几天293就会了，，，
: Z( r& V: q0 R) v5 U% r# w& S7 ]8 M( t) \0 g; Q- f4 s; G- N
我也是边学边做的。。。。。

helenkim

大鼠MSC细胞标志测的有：CD29,CD90,CD34,CD44,CD45等。
0 f, ]# e3 g7 |2 n( @* p3 j其中CD45,CD34为阴性9 `$ e6 m* a7 N$ m0 e" x
CD29,CD90,CD44为阳性

prettybear

) j. m1 B% [! g0 Z/ C* R

3 h* c) f  y: C5 v直接贴壁法，可以得到更多的BMSCs。3 J; `* d) h* `8 z" ]. m9 ~

7 n4 u% y; G* {' u) G2 x4 U( {最原始的分离方法，简单，异行，不用诱导可自发向神经分化。

kqyy

不需要用麻药和肝素,为什么不做流式检测表明抗原呢

qianqianlaile

贴壁法，我们都这样做的，操作简单

mbpsky

我也是贴壁法...不过材料是脐血..除红细胞方法不一样吧....我们是先粗略除去大量红细胞...再精提...

zsc78

最简单就是直接贴壁法，nature protocol上面的方法只需要贴壁几个小时就换液继续培养就可以了。