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本帖最后由 细胞海洋 于 2010-4-13 19:43 编辑
w, P% o. \6 h5 v, n. k1 [& I# ~* }! g# \/ u% Y. y. E9 q- }( ]
前段时间做的脂肪干细胞现在需要做免疫荧光实验。第一次做的时候没有成功，现在做的是先只加荧光剂进行试验，也就是说不加抗体。以下是步骤，有哪些地方需要改进的，希望前辈们指点一下。
8 m; @4 `: n) ]6 J' t1.去除培养的贴壁细胞进行计数，并转移到新的dish（6well）在培养箱中过夜。
' L" D) I& Z8 j- u0 h/ v2.取出细胞，用1*PBS清洗2次，1ml/well，加入3.5%的paraformaldehyde，1ml/well，RT 30min。 Q5 Q, G# i8 X# w Z* O' Y7 u
3.用PBS清洗2次，每次间隔15min
" J0 q6 [* F6 q7 g+ l& d4.加入0.1%Tritonx-100 1ml/well RT 10min.
; u6 X+ H8 g! u& t# c. V5.用PBS清洗2次。加入DAPI 10min RT
5 z; Q. O( Q( y, S+ w6.再用PBS清洗2次，于荧光显微镜下观察。
' ^% f7 n. s# J% ?/ _
# A" ~" k% i t/ b" ?) {以上步骤中，有几点疑问：: E( B& g) a2 P5 [
1.直接做荧光，每次添加试剂后应该用PBS清洗几次。
" x6 D# I3 |0 f+ |! S9 u5 @0 A2.每种试剂的时间应该是多久。
& @( Q. @& {0 Q) g* B8 r* g, a3 g9 W" @# N) n: _% \1 e7 ?0 z
& o8 m" z$ g, ?: D% f* @$ |以下是上一次加入抗体时的实验步骤，其中有何不当之处望指点。（本次试验失败了）
+ i" R; m( M+ T( z5 p) @1.将细胞计数后转移到新的24well上，培养箱中过夜。
3 z- K. r; r& V* A: m2.PBS清洗2次，加入3.5%PFA300ul/well，RT 20~30min
! ~& b7 z6 O7 Q" L c/ f8 {3.去除PFA，PBS清洗3次，加入0.1%Triton 15min RT3 D8 ~3 `' z- m) J8 h2 C5 d
4.PBS清洗3次，加1%BSA 1h RT
# [4 T# ]! M; m: g5 n4 Z7 k5.PBS清洗3次，加1抗（CD29），4℃过夜; ~; _! ^7 S! X# u
6.用PBS清洗3次，加2抗（与BSA混合），RT 2h（避光摇晃）. D0 C' Z: K: e, a* Q" S; k3 j+ x
7.PBS清洗3次，加DAPI300ng/ml，5~10min, W' j# Z: n5 `% J8 i4 a% h
8.PBS清洗3次，荧光显微镜下观察。1 ^: I- X# m7 @. N. M
3 V; C; k3 h0 a- G0 Q以上两个实验步骤望前辈们指导一下需要改进的地方。谢谢！# E9 u( X; A- F
' w4 p. b& { J" m
4楼是刚到荧光显微镜下拍下的图片 |
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发表于 2010-4-13 13:00
发表于 2010-4-13 20:59
