关于DAPI的请教 附详细实验步骤（附图）

duoduo777001

) \( S6 f8 [4 i: {
& K6 L% O/ G& N6 r' v$ x
前段时间做的脂肪干细胞现在需要做免疫荧光实验。第一次做的时候没有成功，现在做的是先只加荧光剂进行试验，也就是说不加抗体。以下是步骤，有哪些地方需要改进的，希望前辈们指点一下。
3 h: N- I' G" c# m. z1.去除培养的贴壁细胞进行计数，并转移到新的dish（6well）在培养箱中过夜。; H: m9 v- V5 i& y8 x5 L
2.取出细胞，用1*PBS清洗2次，1ml/well，加入3.5%的paraformaldehyde，1ml/well，RT 30min。
2 t$ u$ j5 f- V' d5 [# e7 B3 B3.用PBS清洗2次，每次间隔15min& b. I0 x8 ~3 Q  b: M
4.加入0.1%Tritonx-100 1ml/well RT 10min.6 j0 Y( I# ~" X1 u) k$ ^% Y
5.用PBS清洗2次。加入DAPI 10min RT5 W" V: X' D4 u4 Y' C
6.再用PBS清洗2次，于荧光显微镜下观察。& D5 O& d, X; Y# I) C0 a+ e2 P
8 Z" s. z8 G( U! R* ?
以上步骤中，有几点疑问：5 H8 n% ~' `9 r4 z1 F! E
1.直接做荧光，每次添加试剂后应该用PBS清洗几次。
! O' I' O$ `/ c5 E7 A2.每种试剂的时间应该是多久。' p* \' C; Q7 ]! i( F

  o' \9 w0 }! I3 [& n0 |5 V& Y0 O1 }2 a0 C9 Z7 P
以下是上一次加入抗体时的实验步骤，其中有何不当之处望指点。（本次试验失败了）
+ J9 X0 k- r6 ], s. ^, S3 X1.将细胞计数后转移到新的24well上，培养箱中过夜。# W5 p) v7 k  \
2.PBS清洗2次，加入3.5%PFA300ul/well，RT 20~30min
1 C5 y7 D% `2 ^/ G: I3.去除PFA，PBS清洗3次，加入0.1%Triton 15min RT: N( n, m$ W# p- C
4.PBS清洗3次，加1%BSA 1h RT) H. ^2 j( d" `; ~4 s$ \3 ]
5.PBS清洗3次，加1抗（CD29），4℃过夜! l6 x$ A" m& g+ Q3 _# j
6.用PBS清洗3次，加2抗（与BSA混合），RT 2h（避光摇晃）
  ^; B& f' w0 e; K+ n. A, N0 l7.PBS清洗3次，加DAPI300ng/ml，5~10min
& N5 h" H2 b7 {8.PBS清洗3次，荧光显微镜下观察。
* B( \, a" |# r% v4 |# M. V0 a4 G$ Y+ O# _
以上两个实验步骤望前辈们指导一下需要改进的地方。谢谢！
; v/ g( s8 l# R# q4 K, f$ }# w  ^4 ]2 _: w& e# O3 @- T
4楼是刚到荧光显微镜下拍下的图片

ppcl2

PFA一般固定10分钟就够了，少数特殊情况要20-30分，' V: |- w1 z' V+ B: K
Tritonx-100可提高到0.5%，RT5分钟，提高通透性，
" f/ p! J/ T9 r/ V1 ?- tPBS清洗，每回3次，每次大于5分钟，
8 I9 T: E! F) e+ f6 P) j4 VBlock可改用5%马血亲或5%FBS， 二抗RT一个小时就足够了。

savid888

Block buffer最好采用二抗物种来源的非免疫血清

duoduo777001

刚到荧光显微镜下拍下的图片，麻烦各位帮忙找找原因

duoduo777001

第一张发重复了，以下是每张照片的描述  ^8 u/ ~+ l/ |: b5 W
1-1：人脂肪干细胞，细胞计数2.0*105（10的5次方）3.5%PFA 10ug/ml

duoduo777001

2-1 人脂肪细胞，PBS清洗3次/ m! }9 |# [( y+ H5 o
3-1 兔血干细胞，PBS15min清洗2次,3.5%PFA     DAPI  10ug/ml) I; V$ m8 }: X; N% o" W* x
4-1 人脂肪干细胞，PBS15min清洗2次，1%PFA   DAPI   1ug/ml

decloud2009

第一：cd29貌似不需要二抗吧，
' {0 D: M5 X- _1 ^6 `4 B+ z第二：我们用的漂洗液是pbs+血清+triton。. c% l2 _1 ^0 ^6 }9 n4 g
第三：一个免疫荧光用6孔，是不是太浪费了啊，24孔就够了，9 L2 E! C0 ^$ g6 ?% M
第四：我用血清来封闭的。
5 G2 ?2 y# R  ~7 Q  `3 y$ A& `第五：从加一抗以后所有的步骤都要避光。
8 r5 y( {# g' `+ F3 g8 x! S第六：清洗的时候一般是三次，最好放在摇床上吧。* r+ R& b2 V- q. ]5 L$ H( r1 p- O9 C4 m
第七：为什么你的照片是黑白的阿。

痞子的烟头

封闭用血清+TRITON，双染时，封闭血清与二抗不同，单染时封闭血清与二抗一致* E& k0 [6 L& a3 P- d
加二抗之前一般洗三次，二抗洗八次，DAPI染一般五分钟就OK了，

dragon513

封闭应该首选用与二抗来源相同种属的动物正常血清进行封闭半小时左右。加二抗后更多的是RT半小时至1小时，孵育2小时应该不是失败的关键。奇怪的是背景应该是黑白的呀，你的荧光显微镜的使用方法确认正确吗？我做的时候即使没有荧光背景也不是这样的呀。

bypw

学习了